王向佩，周 鵬，米榮升，沈莉萍，黃 燕，王曉娟，楊曉嬌，石 凱，劉宇軒，雷曉思，陳兆國(guó)，趙 權(quán)

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物源性食品安全研究中心，上海 200241；3. 上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因的克隆與序列比較

王向佩1,2，周 鵬2，米榮升2，沈莉萍3，黃 燕2，王曉娟1,2，楊曉嬌2，石 凱2，劉宇軒2，雷曉思2，陳兆國(guó)2，趙 權(quán)1

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物源性食品安全研究中心，上海 200241；3. 上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

為了解豬源附紅細(xì)胞體（Mycoplasmaspp.）RNA酶P RNA（RNase P RNA，rnpB）基因序列變異狀況，將實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定的53份豬源附紅細(xì)胞體陽性DNA樣品用于rnpB基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的序列與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis）德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）進(jìn)行分析和比對(duì)，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并與16S rRNA判定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果共得到42條豬附紅細(xì)胞體rnpB基因和11條小附紅細(xì)胞體（M. parvum）rnpB基因序列。豬附紅細(xì)胞體上海分離株rnpB基因與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因之間的核苷酸序列相似性為98.1%～100.0%；小附紅細(xì)胞體上海分離株rnpB基因與豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列的相似性為91.0%，與豬附紅細(xì)胞體上海分離株rnpB基因序列相似性為90.0%～91.0%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示豬附紅細(xì)胞體rnpB基因與小附紅細(xì)胞體rnpB基因分布在不同聚簇上，與16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果一致。

豬附紅細(xì)胞體；小附紅細(xì)胞體；rnpB；克??；序列比較

豬的附紅細(xì)胞體?。╡perythrozoonosis）是由附紅細(xì)胞體（Mycoplasma spp.）寄生于豬的紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓等引起的[1,2]，以發(fā)熱、貧血、黃疸為主要臨床癥狀的人獸共患傳染病[3]。該病不僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，而且可以降低豬的生育力，臨床上又常與弓形蟲?。╰oxoplasmosis）、大腸桿菌?。╟olibacillosis）、鏈球菌?。╯treptococcal disease）、溫和性豬瘟（swine fever）等其他疾病并發(fā)感染，不僅給診斷造成困難，而且導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的臨床癥狀甚至死亡，阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。附紅細(xì)胞體宿主廣泛，豬、牛、羊、犬、兔、雞和人等都是附紅細(xì)胞體的易感動(dòng)物，其中豬的發(fā)病率較高，豬附紅細(xì)胞體病是急待控制的重要疫病之一[5]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，寄生在豬體內(nèi)的附紅細(xì)胞體共有兩種，分別為豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis）和小附紅細(xì)胞體（M. parvum）[6-8]。16S rRNA基因由于其極其緩慢的演化速度，在細(xì)菌分類上被廣泛地作為基因間的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，應(yīng)用于物種鑒定。然而附紅細(xì)胞體16S rRNA基因擴(kuò)增的特異性較差[9-11]，常引起非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。RNA酶P RNA（RNase P RNA，rnpB）基因在微生物中是編碼單一RNA的內(nèi)切核糖核酸酶P，其全長(zhǎng)基因?qū)⒔?00 bp。相比16S rRNA序列，rnpB基因具有較高的核苷酸變異率，更適合用于分類單元相近微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究對(duì)經(jīng)16S rRNA鑒定的豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體陽性樣品進(jìn)行rnpB基因部分序列的擴(kuò)增，分析其在種內(nèi)及種間的差異，探索其在豬源附紅細(xì)胞體鑒別診斷中的價(jià)值，進(jìn)一步了解豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因變異狀況，為鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類，準(zhǔn)確診斷附紅細(xì)胞體病打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬源附紅細(xì)胞體陽性樣品DNA豬附紅細(xì)胞體陽性DNA樣品42份、小附紅細(xì)胞體陽性DNA樣品11份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所隱孢子蟲病防治課題組保存提供，這些樣品分離自上海市長(zhǎng)寧區(qū)、松江區(qū)、嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)，經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定種類。

1.2 酶及試劑LA Taq酶、pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；O’GeneRulerTMUltra Low Range DNA Ldder購自 Ferment公司；2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自Axygen公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-t1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成根據(jù)文獻(xiàn)[12]中報(bào)道的引物序列設(shè)計(jì)形成，上游引物：5'-TATTTAAAGTAGAGGAAAGTC -3'，位于rnpB基因（登錄號(hào)：EF523602）10～30處；下游引物：5'-GAGGAGTTTACCGCGTTT -3'，位于206～223處。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為214 bp。

1.4 附紅細(xì)胞體rnpB基因的擴(kuò)增取出－20℃冰箱保存的陽性樣品DNA，進(jìn)行豬附紅細(xì)胞體以及小附紅細(xì)胞體rnpB基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括5 U/μL LATaq酶0.5 μL，10×LA Taq PCR buffer Ⅱ 5.0 μL，100 μmol/L上、下游引物各0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP 8 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O 35.3 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火120 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后由凝膠成像系統(tǒng)Image Quant300（美國(guó)GE公司）拍照。

1.5 rnpB基因序列測(cè)定與分析將PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD18-T載體連接，進(jìn)行基因克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，陽性菌液送上海華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行在線BLAST同源性搜索，用DNAMAN軟件（版本7.0.2.176）進(jìn)行基因的核苷酸序列相似性分析，用DNASTAR中的Megalign軟件（版本7.0.1.44）進(jìn)行序列同源性比較，利用BioEdit軟件（版本號(hào)7.0.9.0）對(duì)序列進(jìn)行Clustal W分析。

1.6 不同種間rnpB基因的進(jìn)化樹分析從GenBank下載豬附紅細(xì)胞體（登錄號(hào)：EF523602、EU078611）、小附紅細(xì)胞體（登錄號(hào)：AB614639、AB614640、AB614641）、溫氏附紅細(xì)胞體（M. wenyonii，登錄號(hào)：EU078610）、綿羊附紅細(xì)胞體（M. ovis，登錄號(hào)：EF078612）、球狀附紅細(xì)胞體（M. coccoides，登錄號(hào)：EU078619）、發(fā)酵支原體（M. fermentans，登錄號(hào)：U41756）、貓附紅細(xì)胞體（M. haemofelis，登錄號(hào)：EU078617）、犬附紅細(xì)胞體（M. haemocanis，登錄號(hào)：EU078618）、嗜血小附紅細(xì)胞體（M. haematoparvum，登錄號(hào)：EU078616），以及CandidatusMycoplasma haemolamae（登錄號(hào)：EU078613）、CandidatusMycoplasma haemominutum（登錄號(hào)：EU078614）、CandidatusMycoplasma kahanei（登錄號(hào)：EU078615）、CandidatusMycoplasma aoti（登錄號(hào)：HM123756）、CandidatusMycoplasma haemocervae（登錄號(hào)：AB561882）、CandidatusMycoplasma turicensis（登錄號(hào)：EF212002），用Mega 5.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining method，NJ）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體共53份陽性DNA樣品進(jìn)行rnpB基因擴(kuò)增，均得到大小約為210 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)計(jì)大小相符。圖1為部分樣品擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR products of rnpB gene of swine Mycoplasma spp.

2.2 測(cè)序結(jié)果及分析共獲得53條豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因部分序列，其中豬附紅細(xì)胞體42條，序列長(zhǎng)度均為214 bp；小附紅細(xì)胞體11條，序列長(zhǎng)度均為210 bp。利用BioEdit軟件（版本號(hào)7.0.9.0）對(duì)序列進(jìn)行Clustal W分析。獲得的42條豬附紅細(xì)胞體序列，剔除彼此間完全相同的序列26條，最終剩余16條序列，其代表性編號(hào)為：JD-9、JD-11、JD-12、JD-28、JD-30、JD-32、JD-33、JD-50、SJ-2、SJ-5、SJ-14、SJ-142、SJ-157、SJ-159、SJ-162、SJ-169；獲得的11條小附紅細(xì)胞體基因序列完全相同，其代表性序列編號(hào)為CN-180。

與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株部分rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）相比，獲得的16條豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列共有15處堿基發(fā)生突變（圖2），特別是在基因第114位，有13條序列同時(shí)發(fā)生突變，由胞嘧啶（cytosine，C）突變?yōu)橄汆堰剩╝denine，A）；另外，JD-12分離株在第149位由胸腺嘧啶（thymine，T）變成腺嘌呤，SJ-169株在第106位由鳥嘌呤（guanine，G）變成腺嘌呤，即都是由其他3種堿基突變?yōu)橄汆堰省D-50株和SJ-5株的第35位堿基，JD-30株和SJ-14株的第64位堿基，JD-32株的第71位、112位堿基，JD-11株的第116位堿基，SJ-162株的第133位堿基都由腺嘌呤突變成鳥嘌呤。而SJ-159株的第55位堿基，SJ-142株的第80位堿基，JD-30株、SJ-157株、SJ-169株的第118位堿基，SJ-142株的第119位堿基，JD-28株的第148位堿基，SJ-2株的第175位堿基都由胸腺嘧啶變成胞嘧啶。不同豬附紅細(xì)胞體分離株間rnpB基因種內(nèi)核苷酸序列的相似性為98.1%～100.0%（圖3）。

圖2 豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體不同分離株rnpB基因核苷酸序列的比對(duì)Fig.2 Nucleotide sequence alignment of rnpB gene from M. suis and M. parvum isolates

獲得的小附紅細(xì)胞體CN-180分離株與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）相比，共發(fā)生4個(gè)堿基的缺失（圖2）。另外，還有18處發(fā)生堿基突變，其中有8處是胸腺嘧啶與胞嘧啶之間的互換，有8處是腺嘌呤與鳥嘌呤之間的互換，還有2處分別是腺嘌呤突變成胸腺嘧啶與胞嘧啶，兩者序列的相似性為91.0%；而與16條豬附紅細(xì)胞體上海分離株rnpB基因相比，種間核苷酸序列的相似性為90.0%～91.0%（圖3）。所獲得的16條豬附紅細(xì)胞體和1條小附紅細(xì)胞體上海分離株rnpB序列均已遞交GenBank，登錄號(hào)為KJ637150～KJ637165。

圖3 豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體不同分離株rnpB基因核苷酸序列相似性比較Fig.3 Nucleotide acid sequences homologies of rnpB gene from M. suis and M. parvum isolates

2.3 豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列和小附紅細(xì)胞體rnpB基因序列分布在2個(gè)不同的聚簇上。其中，從上海市分離獲得的16條豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）分布在一個(gè)大的聚簇上，該聚簇又分成3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的聚簇，其中JD-12、JD-28、JD-30、JD-33、SJ-2、SJ-14、SJ-142、SJ-157、SJ-159、SJ-162、SJ-169組成一個(gè)分支；JD-9、JD-11、JD-50、SJ-5與德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）在同一分支上；而JD-32單獨(dú)組成一個(gè)分支。小附紅細(xì)胞體CN-180 rnpB基因序列在另外一個(gè)不同的分支上，與GenBank下載的其他小附紅細(xì)胞體rnpB基因共同組成一個(gè)聚簇（圖4）。

圖4 豬附紅細(xì)胞體與小附紅細(xì)胞體rnpB基因部分核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequences of rnpB gene from M.suis and M.parvum

3 討論

本研究根據(jù)GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）設(shè)計(jì)引物，對(duì)上海市附紅細(xì)胞體感染豬血液樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得了53條豬源附紅細(xì)胞體rnpB基因部分序列，其中豬附紅細(xì)胞體42條，小附紅細(xì)胞體11條。剔除彼此間完全相同的序列，最終獲得16條豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列，1條小附紅細(xì)胞體rnpB基因序列。

在對(duì)16株豬附紅細(xì)胞體rnpB基因進(jìn)行種內(nèi)突變分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同豬附紅細(xì)胞體分離株rnpB基因間核苷酸序列的變異率為0%～1.9%。多數(shù)序列在基因第114位同時(shí)由胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰?，也有個(gè)別位點(diǎn)序列由其他堿基突變?yōu)橄汆堰省Ｆ溆鄠€(gè)別序列在個(gè)別位點(diǎn)也零星發(fā)生突變，但很有規(guī)律，都是由腺嘌呤轉(zhuǎn)換成鳥嘌呤或者由胸腺嘧啶轉(zhuǎn)換成胞嘧啶。即多數(shù)序列位點(diǎn)集中由胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰剩鴤€(gè)別序列的零星突變都是嘌呤與嘌呤間、嘧啶與嘧啶間的轉(zhuǎn)換。序列同源性比較以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)從上海市嘉定區(qū)采集的樣品JD-9的rnpB基因序列與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）核苷酸序列100%相似，其余序列變異率為0.5%～1.9%，差異都不顯著，說明rnpB基因進(jìn)化過程中受地域等因素影響較小，在該病的兩個(gè)流行地—?dú)W洲與亞洲地域間差異不大。

小附紅細(xì)胞體CN-180分離株與豬附紅細(xì)胞體分離株相比，共發(fā)生4個(gè)堿基的缺失，其中3個(gè)腺嘌呤的缺失是連續(xù)的。共發(fā)生18處堿基的突變，且?guī)缀醵际青奏づc嘧啶、嘌呤與嘌呤間的轉(zhuǎn)換，且 轉(zhuǎn)換頻率基本相等，僅個(gè)別位置發(fā)生腺嘌呤與嘧啶間的顛換。與GenBank登錄的豬附紅細(xì)胞體德國(guó)分離株rnpB基因序列（登錄號(hào)：EF523602）相比，核苷酸序列的變異率為9.0%；與16條豬附紅細(xì)胞體rnpB基因核苷酸序列種間變異率為9.0%～10.0%，說明這兩個(gè)種有明顯的差異。

以往的研究中，人們主要是根據(jù)豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體的形態(tài)和致病性的不同將它們區(qū)別開來[12,13]。隨著小附紅細(xì)胞體16S rRNA基因及rnpB基因的公布，也可以通過分子手段將其與豬附紅細(xì)胞體鑒別開來。為了進(jìn)一步 評(píng)估豬源附紅細(xì)胞體兩個(gè)種間遺傳進(jìn)化關(guān)系以及堿基改變是否導(dǎo)致密碼子編碼錯(cuò)誤，Watanabe等[14]依據(jù)Zuker和Stiegler算法比較了豬源附紅細(xì)胞體兩個(gè)種不同分離株株rnpB基因次級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們都存在GAAA tetraloop模塊（即tetraloop受體），該模塊在核糖酶作用過程中起著重要作用。結(jié)果顯示，這兩個(gè)種的RNA酶P RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)莖部區(qū)域核酸堿基對(duì)是可變的，可以形成一個(gè)穩(wěn)定的次級(jí)結(jié)構(gòu)，使自由能最小化。模塊核苷酸堿基對(duì)的替換導(dǎo)致進(jìn)化的改變，可能產(chǎn)生新的基因型或物種。

由rnpB基因編碼的核糖核酸酶P是具有酶活性的核糖核蛋白復(fù)合體，它普遍存在于各種生物體中，催化前體tRNA 5'端的成熟。相比16S rRNA基因，rnpB基因具有相對(duì)較高的核苷酸變異率，更適合用于分類單元相近物種間的系統(tǒng)發(fā)育分析。Tapp等[15]對(duì)鏈球菌屬（Streptococcus）的50個(gè)典型菌株和20個(gè)其他菌種進(jìn)行了rnpB基因的序列測(cè)定，結(jié)果證明rnpB基因適合用于分類單元接近細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析，有可能成為物種鑒定的一種工具。Peters等[16]對(duì)部分動(dòng)物源附紅細(xì)胞體和其他支原體進(jìn)行了部分rnpB基因的PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行種型鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明所有的動(dòng)物源附紅細(xì)胞體都在同一個(gè)分支上，且與厭食支原體（Mycoplasma fastidiosum）接近，這與其16S rRNA 系統(tǒng)進(jìn)化分析鑒定結(jié)果相同。Watanabe等[14]用16S rRNA基因?qū)?株豬源附紅細(xì)胞體陽性菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)這6株菌株分別位于豬附紅細(xì)胞體聚簇和另一個(gè)新簇上，進(jìn)一步分析新簇所在菌株的rnpB基因初級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與豬附紅細(xì)胞體有明顯區(qū)別，證明其可能屬于小附紅細(xì)胞體或者另一個(gè)新種。本研究對(duì)上海市分離的16株豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列、1條小附紅細(xì)胞體rnpB基因序列，以及GenBank下載的多株豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，豬附紅細(xì)胞體rnpB基因序列和小附紅細(xì)胞體rnpB基因序列分別分布在2個(gè)不同的聚簇上，其中，豬附紅細(xì)胞體rnpB基因組成一個(gè)大的聚簇，該聚簇由3個(gè)分支構(gòu)成；而小 附紅細(xì)胞體rnpB基因序列組成另外一個(gè)單獨(dú)的聚簇（圖4），有效地區(qū)分了豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體，證明該基因序列可以用于豬源附紅細(xì)胞體種間的鑒別，其鑒別結(jié)果與基于16S rRNA基因的種型鑒定結(jié)果一致。而且由于其序列較短，更利于進(jìn)行基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，增加了反應(yīng)的特異性，可以方便地用于田間豬源附紅細(xì)胞的鑒別。

綜上所述，本研究對(duì)經(jīng)上海市田間分離的豬附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體rnpB基因進(jìn)行了序列測(cè)定和比較，豐富了該基因序列信息，為進(jìn)一步了解其變異狀況，鑒別豬源附紅細(xì)胞體種類和準(zhǔn)確診斷附紅細(xì)胞體病打下基礎(chǔ)。下一步將克隆和分析感染人和其他畜禽的附紅細(xì)胞體rnpB基因，觀察其能否廣泛地應(yīng)用于各種動(dòng)物感染的附紅細(xì)胞體的鑒別診斷，以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

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CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF RNPB GENE OF MYCOPLASMA SPP. ORIGIN OF SWINE

WANG Xiang-pei1,2, ZHOU Peng2, MI Rong-sheng2, SHEN Li-ping3, HUANG Yan2, WANG Xiao-juan1,2, YANG Xiao-jiao2, SHI Kai2, LIU Yu-xuan2, LEI Xiao-si2, CHEN Zhao-guo2, ZHAO Quan1
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Animal-borne Food Safety Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Shanghai Center of Animal Disease Control, Shanghai 201103, China)

The present study was designed to illustrate variation of RNase P RNA (rnpB) gene ofMycoplasmaspp. origin of swine. PartialrnpBgene ofMycoplasma suisandM.parvumwas amplifi ed in PCR from 53 genomic DNAs extracted from pig blood samples, which had been identifi ed asMycoplasmaspp. positive by 16S rRNA gene sequence analysis. The amplifi ed products were cloned into pMD18-T vector for sequencing. The obtained sequences were compared with the sequence ofrnpBgene ofM. suisGerman isolate in GenBank (Accession number：EF523602). The phylogenetic tree was constructed based on nucleotide sequence ofrnpBgene ofdifferent species using MEGA 5.0 software and the results ofMycoplasmaspecies identification were compared with those of 16S rRNA assessment. Total 42rnpBgenes of differentM. suisisolates and 11rnpBgenes of differentM. parvumisolates were cloned and sequenced. Homology analysis showed that the nucleotide sequence identities were 98.1%-100.0% betweenM. suis rnpBgene of Shanghai isolates and German isolate, 91.0% betweenrnpBgene ofM. parvumShanghai isolates and German isolate and 90.0%-91.0% betweenM. parvumandM. suisShanghai isolates. ThernpBgenes ofM. suisandM. parvumdistributed in different clusters of phylogenetic tree, which was consistent with 16S rRNA gene assessment.

Mycoplasma suis;M. parvum; rnpBgene; cloning; sequence alignment

S852.64

A

1674-6422（2014）03-0026-08

2014-03-17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)項(xiàng)目（200903036）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014JB04）

王向佩，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

陳兆國(guó)，E-mail: zhaoguochen@shvri.ac.cn；趙權(quán)，E-mail: zhaoquan0825@163.com