利用基因芯片技術(shù)篩選食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子靶標

張琪琪張志強溫浩1李秀娟2

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，新疆烏魯木齊830054)

摘要〔〕目的探討應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的相關(guān)機制。方法利用Transwell侵襲小室技術(shù)建立具有不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的人食管鱗癌Eca109和 Eca109-T4細胞株；分別提取Eca109和Eca109-T4的總RNA，用轉(zhuǎn)錄Cy5和Cy3熒光標記成cDNA探針，再與Affymetrix基因芯片雜交，雜交信號用Genechip? Scanner 3000掃描，SAM 3.0軟件分析和處理數(shù)據(jù)；運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對CXCR7、SDC2、HSP90α1、TNFRSF10D基因進行驗證。結(jié)果篩選出Eca109和Eca109-T4差異基因有80個：與母系比較，在Eca109-T4中上調(diào)表達的基因有34個，下調(diào)表達的基因有46個。經(jīng)qRT-PCR驗證：CXCR7在Eca109-T4中的mRNA表達量(9.86±1.38)顯著高于Eca109(6.04±1.88，P<0.05)，SDC2在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.07±0.006 7)顯著高于Eca109(0.04±0.003 7，P<0.05)，HSP90α1在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.18±0.046 0)顯著高于Eca109(0.05±0.009 8，P<0.05)，TNFRSF10D在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.009±0.000 6)與 Eca109(0.005±0.004 0，P>0.05)無明顯差異。結(jié)論基因芯片技術(shù)是一高效篩選食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的方法，CXCR7、SDC2、HSP90α1等基因可能與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕食管癌；轉(zhuǎn)移；基因芯片；差異基因

中圖分類號〔〕R735.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.81001101)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(No.2010211B20)

通訊作者：張志強(1976-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床及消化道內(nèi)窺鏡方面的研究。

1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

2新疆醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室

第一作者：張琪琪(1987-)，女，碩士，主要從事消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

Screening invasion and metastasis related molecular targets of esophageal cancer cell lines by gene chip technology

ZHANG Qi-Qi,ZHANG Zhi-Qiang,WEN Hao,etal.

First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo screen esophageal cancer invasion and metastasis associated genes to understand esophageal squamous carcinoma invasion and metastasis related mechanisms by gene chip technology.MethodsTranswell invasion chamber technology was used to establish human esophageal squamous carcinoma Eca109 and Eca109-T4 cell lines with different invasion and metastasis ability.Eca109 and Eca109-T4 total RNA were extract,ed and reversed transcribed into cDNA probes which labeled with cy5 and Cy3 fluorescence,then it were hybridized by Affymetrix gene chip.Genechip?-Scanner 3000 scan hybridization signal was used, and CXCR7,SDC2, HSP90α1 and TNFRSF10D genes were analyzed by real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR).Results80 differentially expressed genes were identified between Eca 109 and Eca109-T4.Compared to Eca109，34 of 80 differentially expressed genes were upregulated and the remaining 46 were downregulated. qRT-PCR showed that the expressions of CXCR7,SDC2,HSP90α1 at mRNA level were significantly higher in Eca109-T4(9.86±1.38，0.07±0.0067，0.18±0.046 0) than thatose in Eca109(6.04±±1.88,0.04±0.003 7，0.05±0.009 8，P<0.05).But there was no obvious difference in the expression of TNFRSF10D gene between Eca109-T4 (0.009±0.000) and Eca109 (0.005±0.004 0,P>0.05).ConclusionsGene chip technology is a high efficiency method to screen esophageal cancer metastasis related gene. CXCR7,SDC2 and HSP90α1 may be associated with esophageal cancer metastasis and invasion mechanism.

【Key words】Esophageal cancer;Metastasis;Gene chip;Genetic variations

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，五年生存率非常低〔1〕，主要是由于多數(shù)患者首次就診時已發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移，并且手術(shù)后多數(shù)患者仍會死于復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移?；虻娜笔Щ蛲蛔兪窃S多腫瘤發(fā)生的原因之一。在前期的研究中本課題組利用 Transwell侵襲小室從食管鱗狀細胞癌(ESCC)母株Eca109中成功地篩選出具有高侵襲能力的亞系Eca109-T4〔2〕。本文利用基因芯片技術(shù)檢測Eca109與Eca109-T4不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的食管癌細胞株基因表達，篩選食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。

1材料與方法

1.1材料DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；食管癌Eca109細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫；Transwell侵襲小室(Matrigel Invasion Chamber)購自美國BD公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTT試劑購自美國Invitrogen公司；Affymetrix基因芯片購自北京博奧公司；SYBR Premix以及各基因引物均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2Transwell侵襲小室篩選食管癌細胞株收集用無FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)了24 h的Eca109細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2～3次，用無FBS的培養(yǎng)基稀釋使其濃度為5×104/ml。Transwell侵襲小室的下室加入含10%的FBS的培養(yǎng)基600 μl，上室加入200 μl細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)72 h。將侵入到下室的細胞常規(guī)培養(yǎng)傳代并進行后續(xù)三次篩選，將第四次篩選的細胞命名為Eca109-T4。

1.3體內(nèi)、體外實驗驗證篩選的食管癌細胞株的不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能

1.3.1細胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT法測生長曲線、細胞劃痕實驗兩系細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并且用MTT法測定細胞生長曲線。取對數(shù)生長期細胞，每孔以2×105個細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞達90%融合時，用10 μl無菌槍頭在每孔底部畫一條直線，PBS洗滌1次，加入新的培養(yǎng)液。分別在不同時間點觀察劃痕的愈合速度。

1.3.2體內(nèi)裸鼠成瘤實驗把BALB/C裸鼠32只隨機分為兩組。收集處于對數(shù)生長期的兩系細胞，用0.9%生理鹽水稀釋使其濃度為5×109/L。分別取0.2 ml細胞懸液注入裸鼠的右側(cè)腋部皮下，每天觀察兩組裸鼠的成瘤和生長情況。

1.4基因芯片技術(shù)篩選食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)差異基因

1.4.1RNA的提取和擴增、標記用Trizol試劑提取Eca109和Eca109-T4的總RNA各3管，符合標準的RNA經(jīng)過柱純化后可進行探針標記。RNA樣品的標記采用改良的cRNA線性擴大標記法：用總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Eca109采用cy5-dCTP熒光標記cDNA，Eca109-T4采用cy3-dCTP熒光標記cDNA，用Nucleospin?Extract Ⅱ(MN公司)進行純化。

1.4.2芯片雜交與清洗將標記的cDNA取3.6 μl溶于雜交液中 (3×SSC 1.8 μl，0.2%SDS 2.4 μl，5× DDenhart′s 1.2 μl，25%甲酰胺 3.0 μl)，共12 μl體系，于42℃、60 r/min旋轉(zhuǎn)雜交14 h，吸走雜交液，先在42℃左右含有0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)，2×檸檬酸鈉(SSC)的溶液中洗4 min，而后在0.2×SSC中42℃洗4 min，玻片甩干后即可用于掃描。

1.4.3芯片掃描、圖像采集與數(shù)據(jù)分析芯片用GeneChip?Scanner 3000雙通道激光掃描儀進行掃描，把圖像轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，然后對芯片的數(shù)據(jù)用Lowess方法進行歸一化，用SAM 3.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計算每個基因點的表達差異值Ratio，Ratio=Cy5/Cy3，篩選出Ratio>2或<0.5的基因點為存在表達差異的基因，并對發(fā)生顯著變化的基因進行Pathway、Go聚類分析(基因按照所在通路、功能分類的富集度分析)。

1.5實時熒光定量PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)移相關(guān)差異基因用Trizol試劑提取兩系細胞的總RNA，1.2%的甲醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，并用NanodropTM定量。然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，β-actin和CXCR7、SDC2、HSP90α1、TNFRSF 10D分別為引物進行qRT-PCR，β-actin引物序列：正義5’TGGCACCCAGCACAATGAA 3’，反義5’CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3’；CXCR7引物序列：正義5’AGTTGTTGCAAAGTGCTCAG 3’，反義5’TCTGAGTAGTCGAAGAGATGC 3’；SDC2引物序列：正義5’CCTATTGATGACGATGACTACGC 3’，反義5’TTTGGAAGTGGTCGAGATGTTG 3’，HSP90α1引物序列：正義5’CTGCTTATTTGGTTGCTGAGAAAGT 3’，反義5’TCCTTTATTCTTCGTTCCTCCAAG3’，TNFRSF 10D引物序列：正義5’TTTGCCTTCTTGCCTGCTAT 3’，反義5’ CTGACCTTGACCATCCCTCT 3’。反應(yīng)參數(shù)：①β-actin、CXCR7、SDC2、HSP90α1：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，反應(yīng)40個循環(huán)，熒光檢測，并繪制熔解曲線。②TNFRSF 10D：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，反應(yīng)40個循環(huán)，熒光檢測，并繪制熔解曲線。采用標準曲線進行相對定量比較Eca109和Eca109-T4的CXCR7、SDC2、HSP90α1、TNFRSF 10D mRNA的表達差異。

2結(jié)果

2.1兩系細胞生物特性的體內(nèi)、體外檢測比較倒置顯微鏡下觀察Eca109及Eca109-T4細胞形態(tài)，兩系細胞多呈長梭形、三角形或者多邊形，細胞核多呈圓形，未發(fā)現(xiàn)兩系細胞形態(tài)有明顯的變化。

Eca109-T4的生長增殖能力明顯快于母系(圖1)，第2、4、6、8、10天兩系比較P值均小于0.05(P2=0.009、P4=0.043、P6=0.013、P8=0、P10=0.036)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1　食管癌Eca109細胞株及其亞系Eca109-T4細胞株的 生長曲線

劃痕實驗結(jié)果表明劃痕部位的細胞逐漸愈合，并且Eca109的愈合速度明顯慢于Eca109-T4。

裸鼠成瘤實驗：以皮下腫瘤結(jié)節(jié)的直徑超過0.5 cm為成瘤標準，Eca109和Eca109-T4組的成瘤率都是100%，Eca109-T4組平均瘤重(0.91±0.10)g，顯著高于Ecalop組(0.34±0.07)g(P=0.001)。

2.2基因芯片篩選差異基因雜交后表達譜芯片的掃描結(jié)果符合標準，信號強度高，背景較為均一，無明顯缺陷。

按篩選標準，三次重復(fù)后在芯片中共有23 620個有效數(shù)據(jù)，發(fā)生顯著表達變化的基因有80個，與Eca109比較，在Eca109-T4中上調(diào)表達的基因有34個，下調(diào)表達的基因有46個。聚類分析結(jié)果提示發(fā)生顯著變化的基因Pathway及Go分類的富集度較低。Pathway聚類分析：ABC transporters-General：ABCC6，ABCA13基因；Autoimmune thyroid disease：CGA，NLGN1基因；ECM-receptor interaction：SDC2，THBS1基因；ErbB signaling pathway：ABL2基因；GnRH signaling pathway：CGA基因；Cell adhesion molecules (CAMs)：SDC2基因；Calcium signaling pathway：MYLK基因；Focal adhesion：MYLK，THBS1，PARVA基因；Regulation of actin cytoskeleton：MYLK，MYH10基因；Neuroactive ligand-receptor interaction：CGA基因。見表1~表3。

通過以下4點對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控：①平均背景值：成功的芯片平均背景值通常在20~100，兩張芯片相比較時，最好有相近的背景值。本實驗中6張芯片的平均背景值42~67，且配對的兩張芯片具有相近的背景值。②校正因子：本實驗當中校正因子在4.9~5.5，且配對的兩張芯片之間矯正因子比值小于3。③檢出率：6張芯片的檢出率在44.9%~46.9%。④看家基因：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)3′probe sets 的信號值與其相應(yīng)的5′probe sets信號值的比值通常不超過3，本實驗中其比值1.34~1.42。綜上，軟件導(dǎo)出的RPT文件中的質(zhì)控報告反映本實驗數(shù)據(jù)具有一定的可信度。

2.3實時熒光定量PCR結(jié)果CXCR7在Eca109-T4中的mRNA表達量(9.86±1.38)顯著高于Eca109(6.04±1.88，P=0.047<0.05)；SDC2在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.07±0.006 7)顯著高于Eca109(0.04±0.003 7，P=0.003<0.05)；HSP90α1在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.18±0.046 0)顯著高于Eca109(0.05±0.009 8，P=0.009<0.05)；TNFRSF10D在Eca109-T4中的mRNA表達量(0.009±0.000 6)與 Eca109(0.005±0.004 0，P=0.138>0.05)無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　芯片中部分上調(diào)表達的基因

表2　芯片中部分下調(diào)表達的基因

表3　部分基因Go聚類分析

3討論

腫瘤細胞一接觸到細胞外基質(zhì)就會發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，并會產(chǎn)生基質(zhì)降解酶，最終發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。Transwell侵襲小室目前用于細胞侵襲力的測定〔3〕，本課題組首次利用Transwell侵襲小室從食管癌Eca109篩選出高侵襲力亞系Eca109-T4，并且通過體內(nèi)外實驗驗證了兩系細胞株不同的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，結(jié)果表明兩系細胞均能在體外穩(wěn)定傳代并且各代之間細胞的形態(tài)基本保持一致，亞系Eca109-T4的遷移、增殖能力明顯高于Eca109，因此兩系細胞株能夠進一步用于研究食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制，是篩選食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的良好模型。

基因芯片技術(shù)具有高通量的特點，一次實驗可同時檢測數(shù)百乃至數(shù)千個基因并進行平行分析，具有快速、準確、敏感的特點，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中〔4〕。本文運用基因芯片技術(shù)檢測Eca109及Eca109-T4的基因表達，發(fā)現(xiàn)在兩系細胞中存在著一些差異表達的基因，并對其進行聚類分析，結(jié)果表明食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移是多個基因共同參與的結(jié)果。

糖蛋白激素為alpha多肽(CGA)基因，pathway分析提示它與自身免疫性甲狀腺疾病有關(guān)，并參與GnRH信號通路、刺激神經(jīng)組織的配體受體相互作用。與Eca109相比，Eca109-T4中CGA基因的表達量是母系的3.178倍，提示CGA基因可能參與綁定受體和觸發(fā)某些生物過程，但是目前鮮有關(guān)于CGA基因的研究。

本研究結(jié)果顯示黑素瘤抗原基因A9(MAGEA9)在Eca109-T4中的表達量是Eca109的2.218倍，但MAGEB2的表達量卻只有0.478倍，可見MAGEA9、MAGEB2即使屬于同一家族，但在食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移中所起的作用是相反的，前者可能促進食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移，后者可能抑制食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

多配體蛋白多糖2(SDC2)是硫酸肝素蛋白多糖(HSPG，又稱乙酰硫酸肝素蛋白多糖)組成中的一種〔5〕，由4個成員組成(SDC-1~ SDC-4)〔6〕。Chung等〔7〕指出SDC2與黑色素瘤細胞遷移有關(guān)。Huang等〔8〕證實了SDC2的異常表達與ESCC的不良預(yù)后密切相關(guān)，且具有獨立的預(yù)警意義。本研究結(jié)果提示SDC2參與細胞黏附、受體相互作用過程，實時熒光定量PCR驗證其在T4中mRNA表達量顯著高于母系，可見SDC2在食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，可能會為食管癌的診斷、治療提供新的靶點。趨化因子受體(CXCR)7、熱休克蛋白(HSP)90在多種腫瘤組織中呈高表達〔9〕，其中CXCR7在食管癌的轉(zhuǎn)移中起了重要作用〔10〕，但是目前國內(nèi)及國外文獻中鮮有報道腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF)10D與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果說明CXCR7、HSP90α1可能促進了食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本次基因芯片結(jié)果未提示TNFRSF 10D與食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，與qRT-PCR結(jié)果相同。

總之，本研究通過基因芯片篩選了ESCC Eca109和其高侵襲力亞系Eca109-T4之間異常表達的基因，這些異常表達的基因可能參與ESCC的侵襲轉(zhuǎn)移過程，這使我們對食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移有了進一步的認識，為尋找食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制及其對晚期食管癌的預(yù)后、治療提供了依據(jù)。

4參考文獻

1Chen YK，Chang WS，Wu IC，etal.Molecular characterization of invasive subpopulations from an esophageal squamous cell carcinoma cell line〔J〕.Anticancer Res,2010;30(3)：727-36.

2夏宇，李秀娟，張志強，等.食管癌細胞株高侵襲力亞系的建立及其生物學(xué)特性研究〔J〕.中華腫瘤防治，2012;19(1)：6-9.

3楊從容，王雅棣，景紹武，等.RNA干擾UHRF1基因表達對食管癌細胞生物學(xué)行為的影響〔J〕.腫瘤，2013;33(5)：392-403.

4張紅，楚勝華，馮東福，等.應(yīng)用基因芯片篩選不同膠質(zhì)瘤細胞相關(guān)基因〔J〕.中華實驗外科雜志，2012;29(2)：253-5.

5Mytilinaiou M，Bano A，Nikitovic D，etal.Syndecan-2 is a key regulator of transforming growth factor beta 2/Smad2-mediated adhesion in fibrosarcoma cells〔J〕.IUBMB life，2013;65(2)：134-43.

6宮鋒，張曉，李晉萍.硫酸肝素蛋白多糖在疾病中的作用〔J〕.中國科學(xué)：生命科學(xué)，2010;40(3)：187-201.

7Chung H，Lee JH，Jeong D，etal.Melanocortin 1 receptor regulates melanoma cell migration by controlling syndecan-2 expression〔J〕.J Biol Chem，2012;287(23)：19326-35.

8Huang X，Xiao DW，Xu LY，etal.Prognostic significance of altered expression of SDC2 and CYR61 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Oncol Rep，2009;21(4)：1123-9.

9邱明遠，李健文，鄭民華.CXCR4和CXCR7在腫瘤中的研究進展〔J〕.中國癌癥雜志，2010;20(3)：222-6.

10宋亮，王洲.趨化因子受體CXCR4和CCR7及其配體與食管癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究進展〔J〕.中國腫瘤防治雜志，2010;17(20)：1694-9.

〔2014-05-17修回〕

(編輯袁左鳴)