陳曉燕+黃明珠+張妮+劉歡+朱芳芳+熊志偉

摘要：鋅銅超氧化物歧化酶（cytoplasmic copper/zinc superoxide dismutase，CuZnSOD）是超氧化物歧化酶家族的一種，超氧化物歧化酶在動(dòng)植物的抗氧化和免疫功能中扮演著重要的角色。本研究將南美白對(duì)蝦胞外CuZnSOD基因與pet32a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為18 ku。利用Ni柱親和純化發(fā)酵產(chǎn)物，得到較單一的蛋白，制備了多克隆抗體。

關(guān)鍵詞：胞外CuZnSOD；原核表達(dá)；純化；組織分布

中圖分類(lèi)號(hào)： S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0193-03

南美白對(duì)蝦是當(dāng)今世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類(lèi)之一。近年來(lái)，日益嚴(yán)重的南美白對(duì)蝦病害，已對(duì)某些區(qū)域造成了毀滅性的打擊，隨著我國(guó)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步擴(kuò)大，病原體的變異、新型病原的出現(xiàn)、病害的防控形勢(shì)不容樂(lè)觀[1]。南美白對(duì)蝦病害主要有紅體?。ㄓ址Q(chēng)“桃拉綜合癥”）、蛻殼綜合癥、固著類(lèi)纖毛蟲(chóng)病、白斑病、黑鰓病、弧菌病、亞硫酸鹽中毒癥、應(yīng)激性反應(yīng)[2]。其中弧菌病最為猖獗，近年我國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)特別是華南地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖領(lǐng)域遭受到嚴(yán)重的病害肆虐，發(fā)病率及排塘率都在50%以上，個(gè)別甚至達(dá)到90%。整個(gè)疫情中弧菌貫徹始終[3]。

機(jī)體在對(duì)抗病害、重金屬、環(huán)境等因素脅迫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致負(fù)氧離子等氧化自由基（ROS）的產(chǎn)生[4-5]，高濃度的氧化自由基會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至是細(xì)胞死亡[6]。高濃度氧化自由基的消除需要依靠包括超氧化物歧化酶（SOD）在內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，SOD能將體內(nèi)有毒的負(fù)氧離子歧化為無(wú)毒的氧分子和較低毒性的過(guò)氧化氫分子[7]。鋅銅超氧化物歧化酶（cytoplasmic copper/zinc superoxide dismutase，CuZnSOD）是目前發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)主要細(xì)胞外的發(fā)揮抗氧化作用的抗氧化酶[8]。南美白對(duì)蝦CuZnSOD在蝦體對(duì)抗溶藻弧菌和白斑綜合癥病毒脅迫是扮演著重要的角色[9]。本研究將南美白對(duì)蝦胞外CuZnSOD基因與pet32a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中并成功表達(dá)出融合蛋白。融合蛋白分子量約為 18 ku。利用Ni柱親和純化發(fā)酵產(chǎn)物，制備了多克隆抗體，以期為將來(lái)的南美白對(duì)蝦胞外CuZnSOD的應(yīng)用和研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌Escherichia coli DH5α、E.coli BL21菌株，原核表達(dá)載體pet32a，均由江西科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院生理實(shí)驗(yàn)室保存，PMD-18T載體購(gòu)自TaKeRa公司。

1.1.2 試劑 NC膜為Pall Life Science公司產(chǎn)品，Ni NTA填料，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；預(yù)染低分子量蛋白maker為BIO-RAD公司產(chǎn)品；Tryptone，Yeast Extract，peptone為MD Bioscience公司產(chǎn)品；動(dòng)物蛋白提取試劑盒為上海生工生物有限公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為北京鼎國(guó)生物科技有限公司產(chǎn)品。其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上的南美白對(duì)蝦CuZnSOD基因序列（ADM64316.1）設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的特異性引物，SODs： 5′-GCGAATTCATGAAGACGTTGGCAACTCT

GCTGGCTGTG-3′（包含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)、起始密碼子；SODm-x： 5′-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGGA

ACCCT CTCTCAGTGATGGTGCAGCAGGC-3′（包含XbaⅠ酶切位點(diǎn)、終止密碼子、6×his標(biāo)簽）擴(kuò)增CuZnSOD開(kāi)放性閱讀框（ORF）。引物由深圳華大基因合成。

1.2.2 南美白對(duì)蝦肝胰腺RNA提取和cDNA的合成 取肝胰腺液氮冷凍研磨，按照說(shuō)明書(shū)Trizol法提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)文獻(xiàn)[9]合成cDNA。

1.2.3 擴(kuò)增目的基因 以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物跑1%瓊脂糖膠電泳，紫外燈下切膠，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.4 鑒定目的片段 將上述回收的DNA片段與PMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，送上海生工測(cè)序。測(cè)序正確的載體命名為PMD-18T-SOD。

1.2.5 表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)PMD-18T-SOD和pet32a載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物跑1%瓊脂糖膠電泳，紫外燈下切膠，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物按摩爾比1 ∶ 5混合，按比例加入T4 DNA連接酶，4 ℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α，轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，送上海生工測(cè)序。測(cè)序正確的載體命名為pet32a-SOD。

1.2.6 融合蛋白誘導(dǎo) 將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21，轉(zhuǎn)化后涂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌株接種于含100 mmol/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，加入IPTG，使之終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)3 h后開(kāi)始取樣，每隔 1 h 取樣1次，通過(guò)跑SDS-PAG蛋白膠檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。endprint

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物純化 大量發(fā)酵后，收集菌體，磷酸緩沖液重懸，在超聲波下破碎30 min；8 000 r/min 4 ℃離心15 min，棄上清；用含4 mol/L尿素的緩沖液重新溶解，12 000 r/min 4 ℃ 離心20 min，留上清，0.4 μm濾膜過(guò)濾；依照Ni-NAT操作手冊(cè)進(jìn)行蛋白純化[9]，跑SDS-PAG蛋白膠檢測(cè)蛋白純化情況。

1.2.8 各組織蛋白檢測(cè) 重組蛋白溶液（含0.5～1.0 mg重組蛋白）加等體積弗氏完全佐劑，用注射器混勻，多點(diǎn)注射于大白兔腹部及腹股溝，每隔7 d免疫1次，免疫4次后，收集血清[9]。根據(jù)動(dòng)物蛋白提取試劑盒提取南美白對(duì)蝦眼柄、鰓、肝胰腺、肌肉、腸、血細(xì)胞和心臟的總蛋白，提取的總蛋白分別用Bradford法[10]測(cè)定濃度，血清與蝦各組織20 μg總蛋白按照Towbin法[11]做Western Bolt。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建

以cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，跑1%瓊脂糖凝膠，約 500 bp 處有明顯亮帶，符合預(yù)期大小，經(jīng)測(cè)序證明確為CuZnSOD序列（圖1）；雙酶切連接載體后，轉(zhuǎn)化BL21，擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示有2條亮帶，1條為開(kāi)環(huán)pet32a，1條約500 bp大小為目的片段，證實(shí)構(gòu)建表達(dá)載體成功（圖2）。

2.2 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

構(gòu)建好的表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE跑膠檢測(cè)，以加入IPTG之前菌液為空白對(duì)照，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液在18 ku左右有明顯條帶，與預(yù)期大小相符（圖3）；通過(guò)Ni柱純化后得到較單一條帶；由圖4可知，發(fā)酵液上清沒(méi)有目的蛋白，目的蛋白以包涵體的形式存在；穿透液中仍有少量目的蛋白沒(méi)有結(jié)合上Ni柱，經(jīng)結(jié)合緩沖液洗掉雜帶后，最后通過(guò)剝離洗脫液獲得較純的目的蛋白。

2.3 抗體制備及各組織蛋白相對(duì)量檢測(cè)

純化蛋白免疫新西蘭白兔后，取血清，用抗體稀釋液與肝胰腺總蛋白進(jìn)行Western Bolt，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在18 ku左右有明顯條帶，伴有較多雜帶（圖5）。

3 討論

SOD酶活性在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域已經(jīng)被當(dāng)作動(dòng)物免疫活性的一項(xiàng)指標(biāo)[12-15]。目前，對(duì)蝦中MnSOD有較多研究，胞外CuZnSOD只有在南美白對(duì)蝦中克隆出基因序列，且CuZnSOD mRNA在血細(xì)胞和腸道中表達(dá)量最大，在心臟、眼柄和肌肉表達(dá)量較少[16]。在蝦受到應(yīng)激時(shí)，肌肉顏色變深，在抗氧化防御中起著重要的作用，可能在血液將CuZnSOD蛋白運(yùn)輸至肌肉組織時(shí)，發(fā)揮抗氧化作用，導(dǎo)致肌肉中mRNA含量低，而蛋白表達(dá)量很高。本試驗(yàn)擴(kuò)增目的片段過(guò)程中所用的特異性引物的下游引物SODm-x中直接人為添加6×his 標(biāo)簽和終止密碼子，提前終止了表達(dá)，這樣就能將pet32a載體上自帶的分子量較大的GST標(biāo)簽和一些不必要的氨基酸序列連在表達(dá)的融合蛋白上，所表達(dá)的融合蛋白與源序列更為接近。多克隆抗體具有特異性較低的缺點(diǎn)[17]，制備的兔抗南美白對(duì)蝦胞外CuZnSOD多克隆抗體進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)一些雜帶，但是目的條帶相對(duì)較明顯，多抗可用于下一步試驗(yàn)。SOD在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上有大量應(yīng)用[18]，本試驗(yàn)中的南美白對(duì)蝦胞外CuZnSOD原核表達(dá)及產(chǎn)物純化技術(shù)為其在工業(yè)及農(nóng)業(yè)的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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