宇光海，王翱宇，李海峰，惠 明

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

普魯蘭酶(pullulanase)是一類能夠?qū)Ｒ恍苑纸猞?1,6糖苷鍵的淀粉脫支酶，能產(chǎn)普魯蘭酶的菌種主要有假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)、嗜酸芽孢桿菌(Bacillusacidophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)以及少數(shù)真菌等[1-4]。在食品工業(yè)中，葡萄糖淀粉酶只能水解線性的α-1,4糖苷鍵，而普魯蘭酶可特異性水解支鏈淀粉中的α-1,6糖苷鍵，兩者共同使用可以加快糖化過程并減少葡萄糖淀粉酶的使用量[5]。如今，普魯蘭酶已經(jīng)成為高效利用淀粉的關(guān)鍵酶之一，在果葡糖漿、超高麥芽糖漿以及啤酒生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用[6-8]。此外普魯蘭酶在改性淀粉食品生產(chǎn)中也有應(yīng)用，比如生產(chǎn)抗消化淀粉、緩消化淀粉、歧化環(huán)糊精以及直鏈淀粉等[9-11]。然而，普魯蘭酶工業(yè)化生產(chǎn)仍面臨單位發(fā)酵酶量低、生產(chǎn)成本高等難題，嚴(yán)重影響普魯蘭酶的工業(yè)化應(yīng)用[12]。

目前，產(chǎn)普魯蘭酶工業(yè)菌株的育種研究主要應(yīng)用傳統(tǒng)誘變育種及基因工程技術(shù)，基因工程育種技術(shù)主要包括對產(chǎn)普魯蘭酶野生菌株的直接改造及普魯蘭酶的異源表達(dá)。普魯蘭酶異源表達(dá)雖有較高的表達(dá)量，但容易形成包涵體且復(fù)性困難[13]；對產(chǎn)普魯蘭酶野生菌株的直接改造不僅操作復(fù)雜而且成本較高[14]；傳統(tǒng)的紫外誘變及化學(xué)誘變，不僅正突變率較低而且存在潛在的毒害危險。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)具有正突變率高、成本低、易操作、安全等優(yōu)勢，已成功運用于各種產(chǎn)酶微生物育種，如通過采用ARTP對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XZI125進(jìn)行誘變，使納豆激酶活力提高了26.5%[15]；采用ARTP誘變使枯草芽孢桿菌BL03產(chǎn)纖維素酶活力提高了72%[16]；采用ARTP對產(chǎn)葡萄糖氧化酶(GOD)菌株黑曲霉1504進(jìn)行誘變，產(chǎn)酶活力提高至原始菌株的3.31倍[17]。

作者從鄭州市某淀粉廠附近的土壤中篩選得到一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株L5，通過16S rDNA測序、Blast序列對比、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定為芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。以L5菌株為出發(fā)菌株，采用ARTP技術(shù)對其進(jìn)行誘變育種，優(yōu)化誘變參數(shù)，通過3輪誘變篩選出4株普魯蘭酶高產(chǎn)菌株。利用正交試驗對發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

鄭州市某淀粉廠附近的土壤中篩選得到一株產(chǎn)普魯蘭酶菌株L5。

1.1.2 主要試劑

普魯蘭糖：上海瑞永生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；基因組提取試劑盒：TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：普魯蘭糖3.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉20.0 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉(或酵母膏)5 g，KH2PO41 g，CaCl21 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TC-XP-G基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；ZWYR-D2402恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MANDELA多功能等離子體誘變儀：北京偉恩斯技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 普魯蘭酶活力測定

采用DNS法[18]測定普魯蘭酶活力。用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每分鐘生成1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.3.2 16S rDNA鑒定

采用TaKaRa基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，利用16S rDNA通用引物(P0∶5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′和P6∶5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，對L5菌株16S rDNA基因進(jìn)行克隆和測序(賽默飛), 測序結(jié)果提交GeneBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MN148884，并利用MEGA5.1以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 ARTP誘變方法及篩選

以氮氣作為工作氣體(氣流量為12 L/min)，輸入功率115 W，照射距離2 mm，處理時間為10～90 s，間隔為10 s，對L5菌株進(jìn)行誘變。利用生理鹽水稀釋誘變后菌液，涂布篩選培養(yǎng)基平板，37 ℃避光培養(yǎng)24 h后，挑選水解圈直徑大于對照組的菌株，并轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基斜面。

1.3.4 正交法優(yōu)化普魯蘭酶發(fā)酵培養(yǎng)基

首先利用單因素試驗初步確定碳源、氮源、金屬離子最佳組合，碳源：可溶性淀粉、支鏈淀粉、糊精、糊精和可溶性淀粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%；氮源：蛋白胨、黃豆粉、酵母浸粉、蛋白胨和黃豆粉、蛋白胨和酵母浸粉、黃豆粉和酵母浸粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%；金屬離子：K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上選定各因素(可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+)，進(jìn)行七因素三水平正交試驗[19]，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基。

1.3.5 生長曲線及產(chǎn)酶曲線測定

平板培養(yǎng)：將菌株接種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵：將菌株以2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，用DNS法測酶活。

生長曲線及產(chǎn)酶曲線測定：將菌株發(fā)酵40 h，前12 h間隔2 h取樣，12～48 h間隔4 h取樣，測OD600和所產(chǎn)普魯蘭酶活力。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.6.1 普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度和pH值

在不同溫度(35～85 ℃，間隔為5 ℃)及不同pH值(5.0～8.5，間隔為0.5)條件下，分別測定普魯蘭酶活力，確定酶最適反應(yīng)溫度及pH 值。

1.3.6.2 普魯蘭酶的溫度及pH穩(wěn)定性

將酶液分別置于不同溫度(30～80 ℃，間隔為10 ℃)的水浴中保溫2 h后測定酶活力，研究普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性。將酶液分別置于不同pH值(4.0～9.0，間隔為1)的緩沖液中室溫保持4 h后測定酶活力，研究普魯蘭酶的pH穩(wěn)定性。

1.3.6.3 普魯蘭酶動力學(xué)參數(shù)測定

在不同質(zhì)量濃度的普魯蘭糖底物(1～5 mg/mL；溶解于0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖溶液)中加入1 mL酶液，以去離子水為空白對照，測定酶活力，計算出底物不同濃度下酶的反應(yīng)速度，繪制雙倒數(shù)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

將L5的16S rDNA序列進(jìn)行Blast對比分析，結(jié)果表明:L5菌株與芽孢桿菌Bacillussubtilisstrain AB30JX188065.1的相似性超過99%。利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示，菌株L5與Bacillussubtilisstrain AB30JX188065.1、BacillussubtilisIMG04 LC469932.1在同一分支上，表明L5菌株屬于芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。

圖1 L5系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 ARTP誘變

如圖2所示，致死率隨著誘變時間的延長顯著上升。致死率在60 s時達(dá)到79.8%，90 s時趨近100%。誘變時間在30～60 s時正突變率與致死率呈正相關(guān)，60 s達(dá)到最高(正突變率5.1%)，60 s后正突變率隨誘變時間的延長而顯著下降，表明最佳誘變時間為60 s。

圖2 L5菌株ARTP誘變致死率和正突變率曲線

利用水解圈法挑出218株突變菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗證，篩選出發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高的4株正突變菌株G1(20.33 U/mL)、G2(19.68 U/mL)、G3(19.31 U/mL)、G4(22.01 U/mL)，與出發(fā)菌株(10.83 U/mL)相比產(chǎn)酶活力分別提高了87.7%、81.7%、78.3%、103.2%。將普魯蘭酶高產(chǎn)突變菌株G4在斜面固體培養(yǎng)基上進(jìn)行10次傳代培養(yǎng)，并分別接種發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵穩(wěn)定性的研究。結(jié)果表明，G4具有較好的產(chǎn)普魯蘭酶發(fā)酵穩(wěn)定性，產(chǎn)酶活力波動范圍在5%之內(nèi)。

2.3 正交法優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件

2.3.1 單因素試驗

利用單因素試驗初步確定G4菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最佳的碳源、氮源及金屬離子組合。結(jié)果表明，糊精與可溶性淀粉組合為最佳碳源，產(chǎn)酶活力為23.42 U/mL；蛋白胨與黃豆粉組合為最佳氮源，產(chǎn)酶活力為24.39 U/mL；金屬離子中Ca2+、Fe2+、Zn2+對普魯蘭酶活力都有促進(jìn)作用，與對照組相比，產(chǎn)酶活力分別提高了28.8%、45.1%、48.2%。綜合各單因素結(jié)果，確定最佳組合為可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+。

2.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、黃豆粉、Ca2+、Fe2+、Zn2+為因素，設(shè)計七因素三水平正交試驗優(yōu)化普魯蘭酶發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果見表1。

如表1所示，7個因素對G4菌株產(chǎn)普魯蘭酶的影響：可溶性淀粉>Zn2+>Ca2+>糊精>蛋白胨>黃豆粉>Fe2+，并依據(jù)k值確定最佳組合為A3B2C1D3E1F2G3，即可溶性淀粉1.5%、糊精1.0%、蛋白胨0.5%、黃豆粉1.5%、Ca2+0.05%、Fe2+0.10%、Zn2+0.15%，產(chǎn)酶活力為27.22 U/mL，比優(yōu)化前提高了23.7%。由表2可知，在α=0.05條件下，可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、Ca2+、Zn2+的F值分別為230.469、72.378、25.643、110.520、156.622，均大于F0.05(19.000)，表明這5個因素對菌株產(chǎn)普魯蘭酶有顯著影響；而黃豆粉和Fe2+的F值分別為9.337、1.000，均小于F0.05(19.000)，表明這兩個因素對菌株產(chǎn)普魯蘭酶影響不顯著。綜上，影響菌株產(chǎn)普魯蘭酶的關(guān)鍵因素為可溶性淀粉、糊精、蛋白胨、Ca2+、Zn2+。

表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 方差分析

2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶性能

如圖3所示，2 h后L5菌株和G4菌株均進(jìn)入指數(shù)生長期，G4菌株在12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，相比L5菌株提前了4 h；G4菌株在12～40 h(穩(wěn)定期)的OD600達(dá)到9.3～9.6，而L5菌株在16～40 h(穩(wěn)定期)的OD600為8.1～8.5，小于G4菌株，綜上，在各個生長階段G4菌株均比L5菌株生長旺盛。0～24 h菌株L5的產(chǎn)酶活力隨時間不斷提高，在24 h達(dá)到最高值(13.5 U/mL)；G4菌株在0～20 h產(chǎn)酶活力隨著時間不斷上升，在20 h達(dá)到最高值(26.9 U/mL)，比L5菌株提前4 h達(dá)到最高值，且產(chǎn)普魯蘭酶活力提高了99.3%。綜上，普魯蘭酶的合成屬于初級代謝，與菌體生長呈正相關(guān)，因此突變菌株G4旺盛的生長能力是普魯蘭酶高產(chǎn)的重要因素之一。在菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，普魯蘭酶合成量的減少及本身的降解，導(dǎo)致L5菌株和G4菌株產(chǎn)酶活力下降。

圖3 L5與G4菌株的生長和產(chǎn)酶曲線

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 酶最適反應(yīng)溫度與溫度穩(wěn)定性

如圖4(A)所示，35～50 ℃時G4菌株所產(chǎn)普魯蘭酶活力隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度超過50 ℃時，酶活力明顯下降，因此該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃。隨著溫度的升高，G4菌株所產(chǎn)普魯蘭酶活力不斷下降，在30～60 ℃保溫2 h后相對酶活力仍能維持在80%以上，在70 ℃時還有60%的相對酶活力，說明此菌分泌的普魯蘭酶有良好的熱穩(wěn)定性。

2.5.2 酶最適反應(yīng)pH值與pH穩(wěn)定性

如圖4(B)所示，當(dāng)pH值小于6.5時，G4菌株所產(chǎn)普魯蘭酶活力隨pH值的增大而增大；當(dāng)pH值大于6.5時，酶活力隨pH值的增大而減小，由此可判斷該酶的最適反應(yīng)pH值為6.5。根據(jù)普魯蘭酶在食品工業(yè)中的實際應(yīng)用情況，選擇pH 4～9分析酶的pH穩(wěn)定性[20]，在pH 5～9保存4 h后相對酶活力仍能維持在60%以上，在pH值為4時，相對酶活力為50%左右，表明此菌分泌的普魯蘭酶pH值范圍廣，在酸性和堿性條件下都具有一定的酶活力。

圖4 G4菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)特性

2.5.3 酶反應(yīng)動力學(xué)分析

用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以酶促反應(yīng)初速度倒數(shù)1/v對底物質(zhì)量濃度倒數(shù)1/[S]作圖，如圖5所示。通過回歸方程計算得：1/vmax=0.061，Km/vmax=0.061，vmax=16.393 μmol/min，Km=0.999 mg/mL。Km值較低，表明此酶對普魯蘭糖有強的親和性[21]。

圖 5 酶催化不同濃度普魯蘭糖的Lineweaver-Buk曲線

3 結(jié)論

本研究通過16S rDNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法對產(chǎn)普魯蘭酶菌株L5進(jìn)行了鑒定，確定為芽孢桿菌菌屬(Bacillusgenus)。采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變獲得4株普魯蘭酶高產(chǎn)菌株，其中G4菌株的產(chǎn)酶活力最高(22.01 U/mL)，較出發(fā)菌株約提高了2倍，在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)酶活力達(dá)到27.22 U/mL，比優(yōu)化前提高了23.7%。所產(chǎn)普魯蘭酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃、最適反應(yīng)pH值為6.5，30～60 ℃保溫2 h酶活能維持在80%以上，在pH 5～9保存4 h后酶活力仍能維持在60%以上，該酶具有良好穩(wěn)定性。通過酶動力學(xué)試驗驗證，此酶對普魯蘭糖有強的親和性。在大部分食品工業(yè)中，中性支鏈淀粉酶應(yīng)用較廣泛，L5菌所產(chǎn)普魯蘭酶與目前報道的普魯蘭酶相比，反應(yīng)最適pH值靠近中性，熱穩(wěn)定性較好，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。