郭強(qiáng)　李井野　王威　兆勇

摘要目的：初步探索雞屎藤苷酸（PA）誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞惡性增殖和侵襲的可能機(jī)制。方法：選取SGC7901胃癌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用CCK8法進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0、20、40、80 μg/mL的PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡率以及線粒體膜電位變化情況，BrdU法和Transwell小室實(shí)驗(yàn)SGC7901胃癌細(xì)胞的增殖活性以及侵襲能力，qRTPCR檢測(cè)抑癌基因P53、P21的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、cMyc和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白VEGF、波形蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：CCK8梯度濃度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PA濃度從40 μg/mL開(kāi)始對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞活性產(chǎn)生了明顯抑制作用（P<0.05），后續(xù)以20、40、80 μg/mL為試驗(yàn)濃度;與0 μg/mL的PA處理比較，40、80 μg/mL的PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl2、CleavedCaspase3/Caspase3蛋白表達(dá)水平以及P53、P21相對(duì)表達(dá)量升高，線粒體膜電位、細(xì)胞增殖活性、侵襲率、cMyc、VEGF、波形蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論：PA可能通過(guò)降低線粒體膜電位促進(jìn)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)抗癌基因表達(dá)抑制細(xì)胞的惡性增殖，并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化降低侵襲能力。

關(guān)鍵詞胃癌;SGC7901胃癌細(xì)胞;雞屎藤苷酸;惡性增殖;侵襲;轉(zhuǎn)移;凋亡;線粒體膜電位

Paederosidic Acid Induces Apoptosis of Gastric Cancer SGC7901 Cells and Inhibits

Their Malignant Proliferation and Invasion

GUO Qiang，LI Jingye，WANG Wei，ZHAO Yong

（Department of General Surgery，Benxi Central Hospital，Benxi 111027，China）

AbstractObjective：To preliminarily explore the underlying mechanism of paederosidic acid（PA） in inducing the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells and inhibiting their malignant proliferation and invasion.Methods：The concentration gradient test was conducted on SGC7901 cells by CCK8 to determine the subsequent experimental concentration.The changes in the apoptosis rate of SGC7901 cells and mitochondrial membrane potential（MMP） after PA treatment（0，20，40，and 80 μg/mL） were detected by flow cytometry.The proliferation activity and invasion ability of SGC7901 cells were detected by BrdU staining and Transwell assay.The relative expression levels of tumor suppressor genes（P53 and P21） were detected by qRTPCR.The expression levels of apoptosisrelated proteins（Bcl2，Bax，Caspase3，and cMyc） and metastasisrelated proteins（VEGF and vimentin） were detected by Western blot.Results：As revealed by the CCK8 concentration gradient test，PA at the concentration higher than 40 μg/mL showed inhibitory effects on the activity of SGC7901 cells（P<0.05）.The subsequent experimental concentrations were determined as 20，40，and 80 μg/mL.Compared with the results after PA treatment at 0 μg/mL，the apoptosis rate of SGC7901 cells，protein expression levels of Bax/Bcl2 and cleavedCaspase3/Caspase3，and relative mRNA expression levels of P53 and P21 increased，while MMP，cell proliferation activity，invasion rate，and protein expression levels of cMyc，VEGF，and vimentin decreased after PA treatment at 40 and 80 μg/mL（P<0.05）.Conclusion：PA may induce cell apoptosis by reducing MMP and promoting mitochondrial apoptosis pathway to promote the expression of antioncogenes，inhibit malignant proliferation and epithelialmesenchymal transition，and reduce the invasion ability.

KeywordsGastric cancer; SGC7901; Paederosidic acid; Malignant proliferation; Invasion; Metastasis; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential

中圖分類號(hào)：R273;R735.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.008

胃癌是一類常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，多以腺癌為主，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，亞洲范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率占據(jù)全球惡性腫瘤發(fā)生率的第7位，死亡率在10%左右[12]，在我國(guó)胃癌的發(fā)病率僅次于第1位的肺癌，同時(shí)胃癌死亡率在所有惡性腫瘤中排在第3位[3]。化療作為晚期胃癌患者的主要治療方式之一，通常會(huì)伴隨較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而對(duì)于多重耐藥的GC患者而言，化療的臨床受益極低[4]，因此尋找治療胃癌的新方法具有重要的意義。幾千年來(lái)，中醫(yī)藥在人類健康的許多領(lǐng)域都取得了矚目的成就，得到全世界的認(rèn)可。雞屎藤Paederiascandens（Lour.）Merrill.是我國(guó)少數(shù)民族中比較常用的一味民間藥，其分布較廣，大部分分布于亞洲熱帶地區(qū)，具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌的功效[5]，并且其環(huán)烯醚萜苷類成分提取物已被證實(shí)有較好的抗腫瘤活性[6]。但環(huán)烯醚萜苷類成分因?yàn)樘崛〉姆绞讲煌?，其種類也有較大的區(qū)別，因此具體是哪種成分發(fā)揮抗癌作用尚不清楚。本研究以SGC7901胃癌細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探索雞屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA）對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡、增殖以及侵襲的可能機(jī)制，為雞屎藤的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞將已復(fù)蘇的GC7901胃癌細(xì)胞（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素的完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，采用0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用于后續(xù)相關(guān)研究。

1.1.2藥物雞屎藤苷酸（Paederosidic Acid，PA，上海源葉生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：B20585）。

1.1.3試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)，貨號(hào)：23400021，10091148）;總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)：AM1931、4368813、12574030）;CCK8試劑盒（日本同仁，日本，貨號(hào)：VC5001）;Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20190825）;JC1試劑盒（南京生興生物有限公司，批號(hào)：190714）;P53、P21及內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白引物（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：191108、191025、191104）;兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH單克隆抗體（賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)：14102882、336400、PA5114687、MA511521、MA1980、MA513182、MA511883、MA116757）;流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)，型號(hào)：BDFACSCalibur）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（羅氏，德國(guó)，型號(hào)：Roche LightCycler96）;正置熒光顯微鏡（NiKON，日本，型號(hào)：NiKON ECLIPSE TE2000S）。離心機(jī)（Select BioProducts公司，美國(guó)，型號(hào)：Selectspin 17R）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備

1.2.1.1CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性對(duì)照組：GC7901胃癌細(xì)胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細(xì)胞+不同濃度PA（1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.2.1.2流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡對(duì)照組：GC7901胃癌細(xì)胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細(xì)胞不同濃度PA（根據(jù)CCK8最終結(jié)果篩選出實(shí)驗(yàn)濃度，PA濃度終濃度設(shè)置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.3JC1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞膜電位變化情況對(duì)照組：GC7901胃癌細(xì)胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細(xì)胞不同濃度PA（根據(jù)CCK8最終結(jié)果篩選出實(shí)驗(yàn)濃度，PA濃度終濃度設(shè)置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.4BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況對(duì)照組：GC7901胃癌細(xì)胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細(xì)胞不同濃度PA（根據(jù)CCK8最終結(jié)果篩選出實(shí)驗(yàn)濃度，PA濃度終濃度設(shè)置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.1.5Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況對(duì)照組：GC7901胃癌細(xì)胞（未加入PA）;觀察組：GC7901胃癌細(xì)胞不同濃度PA（根據(jù)CCK8最終結(jié)果篩選出實(shí)驗(yàn)濃度，PA濃度終濃度設(shè)置為20、40、80 μg/mL）。

1.2.2給藥方法

1.2.2.1CCK8法檢測(cè)PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響對(duì)照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL。

1.2.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.3JC1試劑盒檢測(cè)不同濃度PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞膜電位變化的影響對(duì)照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.4BrdU法檢測(cè)不同濃度PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞增殖的影響對(duì)照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.2.5Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞侵襲的影響對(duì)照組：未加入PA;觀察組：PA終濃度分別為20、40、80 μg/mL。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)增殖率、CCK8法、BrdU法。具體如下：CCK8法：將培養(yǎng)好的GC7901胃癌細(xì)胞分為10組，分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL的PA后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為2×107個(gè)/L，接種至96孔板上，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，在接種后向每孔滴加10 μL配好的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算不同劑量PA處理后細(xì)胞成活分?jǐn)?shù)，成活分?jǐn)?shù)=處理組OD值/空白對(duì)照組OD值;BrdU法：將培養(yǎng)好GC7901胃癌細(xì)胞懸浮后，加入生理鹽水調(diào)整濃度為5×103/mL接種于96孔板、200 μL/孔，每組3個(gè)復(fù)孔，預(yù)培養(yǎng)12 h，加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后，棄培養(yǎng)液，加入10 μmol/L BrdU繼續(xù)孵育24 h，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛孵育30 min，100 μL過(guò)氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗體1 h，PBS清洗3次，加入四甲基聯(lián)苯胺染色30 min，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)目。

1.2.3.2PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)。具體操作如下：將培養(yǎng)好的GC7901胃癌細(xì)胞調(diào)整為4×104個(gè)/mL，接種于6孔板中、400 μL/孔，每組3個(gè)復(fù)孔，加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，166.5×g離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5 μL AnnexinV/FITC、10 μL PI混合，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，后采用CellQuest軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3.3PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞膜電位變化影響的檢測(cè)紅綠熒光信號(hào)比例，JC1法。具體如下：將培養(yǎng)好GC7901胃癌細(xì)胞懸浮后，加入生理鹽水調(diào)整濃度為2×106/mL，添加到6孔板上，分別加入0、20、40、80 μg/mL的PA處理，培養(yǎng)48 h后，加入1 mL JC1工作液，混合均勻后37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min，并將JC1染色緩沖液按1∶5的比例稀釋，孵育結(jié)束后，吸去上清，用稀釋后的JC1緩沖液清洗3次后，加入流式細(xì)胞測(cè)試緩沖液后上機(jī)，以紅綠熒光信號(hào)比例表示線粒體膜電位情況。

1.2.3.4PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞中P53、P21相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量，實(shí)時(shí)PCR。具體如下：按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作步驟提取0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后GC7901中的總RNA，凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量;反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：2×miRNA反應(yīng)混合液5 μL，0.1% BSA 1 μL，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μL，總RNA 0.5 μL，去RNA酶去離子水（ddH2O） 2.5 μL。反應(yīng)條件設(shè)置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。PCR體系10 μL：SYBR Prmix Ex Tap Ⅱ（2×）5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。詳細(xì)操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR參數(shù)設(shè)置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個(gè)樣孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.5PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞侵襲率影響的檢測(cè)穿膜細(xì)胞數(shù)，Transwell小室試驗(yàn)。具體如下：將鋪有Matrigel膠的Transwell小室預(yù)熱至37 ℃后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后重懸細(xì)胞，分別加入0、20、40、80 μg/mL的PA后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，在Transwell下室放入1 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，上室加入300 μL細(xì)胞懸液后培養(yǎng)36 h。取出小室，利用棉簽輕柔地擦去上層未穿膜的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用冰甲醛對(duì)濾膜進(jìn)行固定后結(jié)晶紫染色。將濾膜剝離后正面朝下固定在載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡（×400）下視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.2.3.6PA對(duì)GC7901胃癌細(xì)胞中凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)量的檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量，Western blotting法。具體如下：提取0、20、40、80 μg/mL的PA處理48 h后GC7901胃癌細(xì)胞中總蛋白，利用BCA法進(jìn)行蛋白定量，并利用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛處理過(guò)預(yù)處理過(guò)的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h，加入兔抗人Bcl2、Bax、CleavedCaspase3、Caspase3、cMyc、VEGF、波形蛋白、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，PBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育1 h，PBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光到X線片上，采用Image J軟件分析各組條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，假設(shè)檢驗(yàn)的標(biāo)尺以α=0.05加以比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖活性的影響隨著PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細(xì)胞的增殖活性也隨之降低，當(dāng)處理濃度為40 μg/mL時(shí)，增殖活性的降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此后續(xù)試驗(yàn)選擇20、40、80 μg/mL作為處理濃度。見(jiàn)圖1。

2.2PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞中JC1紅綠信號(hào)比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞中JC1紅綠信號(hào)比率明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞惡性增殖的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)BrdU染色陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)BrdU染色陽(yáng)性率明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞中Bax/Bcl2比值明顯升高（P<0.05），cMyc表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），

ClaevedCaspase3/Caspase3比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞中Bax/Bcl2、ClaevedCaspase3/Caspase3比值明顯升高（P<0.05），cMyc表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

2.6PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞中P53、P21相對(duì)表達(dá)水平的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)P53、P21相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)P53、P21相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)圖6。

2.7PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞侵襲能力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與0 μg/mL PA處理比較，20 μg/mL PA干預(yù)時(shí)SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)侵襲細(xì)胞數(shù)、VEGF、波形蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），40、80 μg/mL PA處理后SGC7901胃癌細(xì)胞內(nèi)侵襲細(xì)胞數(shù)、VEGF、波形蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖7。

3討論

雞屎藤作為我國(guó)傳統(tǒng)草藥在歷代本草著作中均有記載，主治風(fēng)濕痹病、脘腹疼痛等，且目前已有全草的提取制劑用于臨床[7]。隨著近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)雞屎藤化學(xué)組分和藥理活性研究的不斷深入，其抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、影響胃腸道功能以及抗腫瘤等生物活性被不斷發(fā)現(xiàn)，并且有研究通過(guò)連續(xù)給小鼠注射雞矢藤注射液后未見(jiàn)小鼠活動(dòng)及臟器的異常，可見(jiàn)其安全性較高、毒性小[8]。PA作為一類從雞屎藤中提取主要的環(huán)烯醚萜苷類成分，目前尚未有其抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，隨著PA處理濃度的升高，其對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞系增殖活性的抑制逐漸增強(qiáng)，并且在40 μg/mL時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PA具有抑制腫瘤增殖的作用，并呈濃度依賴。同時(shí)李紅霞等[6]研究證實(shí)雞屎藤環(huán)烯醚萜苷提取物在500 μg/mL劑量及之下時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，進(jìn)一步證實(shí)了PA具有獨(dú)特的抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步研究PA抗腫瘤的可能機(jī)制，本研究選擇20、40、80 μg/mL為實(shí)驗(yàn)濃度。

細(xì)胞凋亡作為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多種抗癌藥物靶向的關(guān)鍵機(jī)制[9]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著PA處理濃度的提高，SGC7901胃癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯升高，并且JC1的紅綠信號(hào)比率明顯降低。JC1作為檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，其聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，而線粒體膜電位降低時(shí)，JC1以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光，因此綠色熒光的增多提示線粒體膜電位下降，而這一現(xiàn)象是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件[10]。Bcl2和Bax蛋白是Bcl2蛋白家族的主要蛋白，由于該家族蛋白的主要位點(diǎn)分布在線粒體膜上，因此主要調(diào)控線粒體凋亡途徑[11]。Bcl2和Bax蛋白作為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。大多數(shù)惡性腫瘤中，Bcl2的表達(dá)升高，而B(niǎo)ax的表達(dá)降低[12]，但PA處理后，SGC7901胃癌細(xì)胞中Bax/Bcl2比值明顯升高，提示PA可能通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白，上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspases3是Caspases家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白，在整個(gè)細(xì)胞凋亡通路中最終都是由Caspases3來(lái)行使凋亡功能，因此Caspases3水平與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[13]。cMyc作為一類與腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖和增殖后結(jié)局密切相關(guān)的蛋白，與腫瘤的惡性程度顯著相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，隨PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細(xì)胞中具有活性的Caspases3表達(dá)水平明顯升高，而cMyc蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明PA能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BrdU熒光染色結(jié)果顯示，隨PA處理濃度的升高，BrdU染色陽(yáng)性率明顯降低，也進(jìn)一步證實(shí)了PA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞惡性增殖能力的抑制效果。P53基因是體內(nèi)非常重要的抑癌基因，能夠介導(dǎo)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]，使細(xì)胞分化停留在G1檢驗(yàn)點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，避免細(xì)胞到下一代時(shí)發(fā)生DNA突變，而發(fā)生癌變[16];P21則是細(xì)胞周蛋白依賴性激酶抑制因子家族中的重要成員，其編碼的蛋白富含精氨酸，能夠抑制細(xì)胞周蛋白依賴性激酶和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，而參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)[17]。本研究中PA處理后，SGC7901胃癌細(xì)胞中P53、P21的相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高，提示PA可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的過(guò)程，來(lái)抑制癌細(xì)胞的惡性增殖。

侵襲、轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征。本研究通過(guò)Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著PA處理濃度的升高，SGC7901胃癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低，提示PA處理抑制了SGC7901胃癌細(xì)胞的侵襲能力。惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，VEGF作為一種血管生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]，還能增加血管的通透性，導(dǎo)致周圍組織的纖維蛋白沉積，有利于腫瘤基質(zhì)的形成及對(duì)新生血管的浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力[19]。波形蛋白是一種中間絲蛋白，在體內(nèi)發(fā)揮著連接細(xì)胞膜和核膜的作用，在間葉組織細(xì)胞中表達(dá)，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要因子，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中尤其是低分化癌中表達(dá)量顯著升高，是判斷腫瘤細(xì)胞是否轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，PA處理后，SGC7901胃癌細(xì)胞中VEGF、波形蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，表明PA可能通過(guò)抑制VEGF、波形蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制了SGC7901胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，PA作為中藥雞屎藤的主要活性成分之一，能夠誘導(dǎo)線粒體膜電位降低，從而激活線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí)還能夠上調(diào)促進(jìn)抗癌基因表達(dá)抑或終止細(xì)胞周期而抑制癌細(xì)胞的惡性增殖，并且還能夠抑制侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，而降低侵襲能力。但本研究只是初步探索了PA調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖作用，其具體的調(diào)控機(jī)制以及是否在體內(nèi)依然有效還有待進(jìn)一步研究。

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（2020-09-01收稿本文編輯：楊燕）文獻(xiàn)研究

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目（2017020388）

作者簡(jiǎn)介：郭強(qiáng)（1981.02—），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：胃腸腫瘤，肝膽胰腺腫，Email：guoqiang198102@163.com