不同接種方式對苦蕎豆醬發(fā)酵過程中理化指標的影響

唐遠謀,拉普莫拉子,劉洋,王娟,徐綱,肖迪,劉達玉,肖龍泉*

(1.成都大學 食品與生物工程學院,成都 610106;2.宜賓市娥天歌食品有限公司, 四川 宜賓 644100;3.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院,重慶 400020)

豆醬是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品,有黃豆醬、豆面醬、豆瓣醬等多種類型,其以霉菌、酵母菌等微生物為發(fā)酵菌種,經(jīng)過預(yù)處理、制曲、發(fā)酵等工藝釀造而成,發(fā)酵過程中將原料中的營養(yǎng)成分降解成可消化的氨基酸、肽類等小分子物質(zhì),在菜肴烹飪過程中可使菜品呈現(xiàn)出更加鮮美的滋味[1-2]。

苦蕎因富含微量元素和多種功能性營養(yǎng)成分[3-4]而被廣泛應(yīng)用在復(fù)合型食品加工領(lǐng)域,開發(fā)的苦蕎系列產(chǎn)品受到越來越多消費者的歡迎,但是關(guān)于苦蕎豆醬的報道較少見。魯氏酵母是一種常見的嗜高滲透壓、能夠在高鹽環(huán)境中生長的酵母菌,最適生長溫度為28～30 ℃,最適生長pH值為4～5[5]。酵母通過降解淀粉質(zhì)原料產(chǎn)生糖類等營養(yǎng)物質(zhì),再代謝產(chǎn)生乙醇,并同時產(chǎn)生高級醇和芳香雜醇類副產(chǎn)物,且可以與豆醬中其他微生物代謝產(chǎn)酸,發(fā)生酯化反應(yīng)并形成酯類物質(zhì),對豆醬的香氣形成具有十分重要的作用[6]?；诖?將苦蕎和大豆復(fù)合,接種魯氏酵母和米曲霉用于苦蕎豆醬的生產(chǎn)工藝,豐富了豆醬發(fā)酵原料,提升了苦蕎黃豆醬的品質(zhì)。研發(fā)的苦蕎豆醬產(chǎn)品既有豆醬特有的風味,又兼具苦蕎的營養(yǎng)保健功能,對提高人民健康水平具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃豆、面粉、苦蕎:購于成都沃爾瑪超市;米曲霉3.042、魯氏酵母:山東和眾康源生物科技有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二甲酸氫鉀(均為分析純):成都市科隆化學品有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PDMS/DVB萃取頭、HP-5MS色譜柱、Agilent 7000D三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司;HZ85-2磁力攪拌機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;PHS-2F pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦蕎黃豆醬制作工藝流程及操作要點

1.3.1.1 苦蕎黃豆醬制作工藝流程

大豆→浸泡→蒸煮→拌苦蕎粉→接種→制曲→加鹽水拌勻→裝罐發(fā)酵→后期成熟→成品。

1.3.1.2 苦蕎黃豆醬操作要點

浸泡大豆:將顆粒飽滿的大豆洗凈,放入容器內(nèi)浸泡8 h左右,大豆與水的質(zhì)量與體積比為1∶3,再將其瀝干備用。

蒸煮:用蒸鍋蒸煮45 min,蒸至大豆熟透而不爛,用手捻時皮可以輕易脫落。

拌粉:用多功能粉碎機將購買的苦蕎麥粉碎至粉狀,將冷卻至45 ℃的大豆與苦蕎粉按質(zhì)量比4∶1(干豆∶苦蕎粉)混合。

人工接種:待拌好的大豆溫度冷卻至45 ℃時進行接種,米曲霉和魯氏酵母的接種量均為干黃豆質(zhì)量的0.04%。在相同的實驗條件下,設(shè)置接種魯氏酵母組、同時接種米曲霉和魯氏酵母組。

制曲:將接種好的曲料放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)至35 ℃,并在每組黃豆上鋪一層紗布,每10 h給黃豆隔紗布噴水,保持一定的濕度并同時翻曲,增加空隙,保持通風,調(diào)控品溫,防止溫度升高引起的燒曲或雜菌污染。

加鹽水裝罐:在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,將黃豆和鹽水(濃度為10%,質(zhì)量與體積比)按1∶1加入已用沸水煮過10 min的玻璃罐中。

1.3.2 蛋白酶活力的測定

參照SB/T 10317-1999 《蛋白酶活力測定法》測定[7]。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮含量的測定

參照GB 5009.235-2016中的電位滴定法測定[8]。

1.3.4 總酸的測定

參照GB/T 12456-2008中的方法進行測定[9]。

1.3.5 揮發(fā)性風味化合物分析鑒定

參照許春艷等[10]的實驗方法,在苦蕎豆醬發(fā)酵的第28天,稱取5.0 g樣品置于頂空瓶中,同時加入1.0 g NaCl用于離子強度調(diào)節(jié);樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)富集提取采用65 μm PDMS/DVB萃取頭,萃取時間為40 min,萃取溫度為50 ℃;萃取后在氣相色譜儀進樣口解吸5 min,進行后續(xù)GC-MS分析。

氣相色譜(GC)條件:采用HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氦氣(He)作為載氣,流速為1.0 mL/min,采用不分流模式進樣;進樣口溫度250 ℃。程序升溫為40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升至100 ℃,再以6 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。

質(zhì)譜(MS)條件:電離方式為電子電離源(EI),電離電壓為70 eV;離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度為150 ℃;在35～400 u范圍內(nèi)全掃描。

采用美國國家標準與技術(shù)研究院NIST08譜庫檢索進行揮發(fā)性化合物的定性分析,保留匹配度大于750的化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏酵母的添加對制曲過程中蛋白酶活力的影響

由圖1可知,在制曲階段,僅接種魯氏酵母組蛋白酶活力始終低于接種米曲霉和魯氏酵母組,這是由于米曲霉具有較強的產(chǎn)蛋白酶能力,從而導(dǎo)致兩組樣品的酶活力差異較大。在僅接種魯氏酵母組中,因未接入米曲霉菌種,碳源消耗相對緩慢,隨著制曲時間的增加,其蛋白酶活力增速相對穩(wěn)定。當制曲時間為12 h時,接種米曲霉和魯氏酵母組的蛋白酶活力出現(xiàn)大幅度上升,隨后增速變慢,這可能是碳源消耗導(dǎo)致米曲霉活力下降。蛋白酶可使蛋白質(zhì)水解成氨基酸,增加氨基酸態(tài)氮含量,因此同時添加魯氏酵母和米曲霉有助于加速制曲進程,減少制曲時間。

圖1 蛋白酶活力隨制曲時間增加的變化Fig.1 Change of protease activity with the increase of koji-making time

2.2 總酸含量隨發(fā)酵時間增加的變化

由圖2可知,隨著發(fā)酵時間的增加,兩組樣品的總酸含量均呈上升趨勢,這是產(chǎn)酸微生物如乳酸桿菌的生長所致,安飛宇等[11]對自然發(fā)酵豆醬中微生物多樣性進行分析,發(fā)現(xiàn)在屬水平上,優(yōu)勢細菌主要為乳酸桿菌屬和四聯(lián)球菌屬。接種米曲霉和魯氏酵母組的苦蕎黃豆醬在發(fā)酵前3 d總酸含量更高,這可能是由于魯氏酵母與米曲霉生長增加了耗氧量,兼性厭氧菌乳酸菌大量繁殖,從而導(dǎo)致總酸含量更高;但在發(fā)酵4 d以后,接種魯氏酵母和米曲霉組的總酸含量相對更低,這可能是微生物群落變化所致。

圖2 總酸含量隨發(fā)酵時間增加的變化Fig.2 Change of total acid content with the increase of fermentation time

2.3 氨基酸態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間增加的變化

由圖3可知,在整個發(fā)酵過程中,接種魯氏酵母和米曲霉組的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于僅接種魯氏酵母組,氨基酸態(tài)氮主要來源于蛋白質(zhì)的降解,結(jié)合圖1可知,在制曲階段接入米曲霉后,曲的蛋白酶活力明顯升高,利于發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的生成。在發(fā)酵第13天時,僅接種魯氏酵母組的氨基酸態(tài)氮含量僅為1.02 g/100 g,而接種魯氏酵母和米曲霉組的氨基酸態(tài)氮含量高達1.27 g/100 g。在發(fā)酵第13～14天,氨基酸態(tài)氮含量未增加,這可能與蛋白酶或蛋白質(zhì)的消耗相關(guān)。

圖3 氨基酸態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間增加的變化Fig.3 Change of amino acid nitrogen content with the increase of fermentation time

圖4 自然接種魯氏酵母的苦蕎黃豆醬氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.4 Total ion flow diagram of tartary buckwheat soybean paste naturally inoculated with Saccharomyces rouxii by gas chromatography-mass spectrometry

圖5 接種米曲霉和魯氏酵母的苦蕎黃豆醬氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.5 Total ion flow diagram of tartary buckwheat soybean paste inoculated with Aspergillus oryzae and Saccharomyces rouxii by gas chromatography-mass spectrometry

2.4 魯氏酵母的添加對苦蕎黃豆醬揮發(fā)性成分的影響

將所檢測到的揮發(fā)性成分分為7大類:醇類、酯類、酸類、酚類、醛類、酮類和其他化合物。由表1可知,在這兩組樣品中,共檢測出48種揮發(fā)性物質(zhì)。只接種魯氏酵母的苦蕎黃豆醬樣品共檢測出揮發(fā)性香氣成分30種,包括9,10-十八碳二烯酸甲酯等13種酯類、3-(4-甲氧基苯基)-3-硒醇等5種醇類、3,4-二羥基-3,4-二甲基-2,5-己二酮等2種酮類、醛類1種(二甲醇縮甲醛)、酸類1種(乙酸)、酚類1種(麥芽酚)、N-甲基嗎啉氧化物等7種其他化合物。接種米曲霉和魯氏酵母的苦蕎黃豆醬樣品檢測出揮發(fā)性成分31種,包括12,13-十八碳二烯酸甲酯等8種酯類、3-(4-甲氧基苯基)-3-硒醇等6種醇類、2-甲基-3-甲氧基-4H-吡喃-4-酮等3種酮類、醛類1種(α-亞乙基-苯乙醛)、酚類1種(麥芽酚)、酸類1種(α-亞乙基-苯乙酸)、1-異硫氰酸-2-甲氧基乙烷等11種其他化合物。

表1 不同樣品中揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in different samples

酯類化合物是豆醬香氣成分最主要的貢獻物質(zhì),其不僅可以增強其他風味化合物的氣味,而且可以為豆醬提供甜香和果香等風味感官特征,主要來源于酵母酶的催化合成,其次來源于有機酸和醇的酯化反應(yīng)合成[12],可以緩和醬的咸味,且可以在一定程度上抑制黃豆醬中的不良、刺激性氣味。乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯在兩組樣品中均被檢測出,研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯是清香型白酒的主要呈香物質(zhì)且主要由生香酵母產(chǎn)生[13-14];棕櫚酸乙酯具有陳油香氣,味醇甜且濃,可以增加食品的醇厚感[15]。此外,具有芳香味的乙酸甲酯、乙酸異戊酯僅在接種米曲霉和魯氏酵母組中檢測到,乙酸異戊酯具有香蕉和梨的氣味。

醇類可以賦予豆醬特殊的香氣,也可以為酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)提供底物,魯氏酵母可以在無氧發(fā)酵條件下代謝產(chǎn)生醇類物質(zhì)[16],發(fā)酵中后期倒醬頻率和溫度下降有利于酯類的生成[17]。在兩組樣品中均檢測到1-辛烯-3-醇,這種物質(zhì)為黃豆醬提供了蘑菇香味[18];而在添加魯氏酵母和米曲霉組中發(fā)現(xiàn)了環(huán)辛醇,說明這是由米曲霉產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物。

醛、酮類物質(zhì)在兩組樣品中均被檢測到,但其組成差異較大,這可能是微生物群落差異造成的;3-辛酮僅在接種米曲霉和魯氏酵母組中檢測到,它是一種具有果實香味的酮類化合物,在雞樅子實體中含量較豐富[19]。在兩組樣品中均檢測到乙酸,可能是乳酸菌等產(chǎn)酸微生物將糖類物質(zhì)分解成乙酸。其他化合物中主要成分是含氮、含硫化合物,值得注意的是,吡嗪類化合物具有特殊香氣,其閾值較低,具有類似烤肉、炒堅果的香味[20],對食品風味的貢獻不容忽視,僅接入魯氏酵母組中檢測到吡嗪類化合物。

兩組間揮發(fā)性成分種數(shù)相差不大,但其風味成分組成差異較大。在苦蕎豆醬制備過程中,僅接入魯氏酵母利于酯類化合物的生成,而接入魯氏酵母和米曲霉利于含硫、含氮化合物的生成。

3 結(jié)論

在制曲階段,接種米曲霉和魯氏酵母有利于加速提升蛋白酶活力。在醬醪發(fā)酵階段,接入米曲霉和魯氏酵母組的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于魯氏酵母組。兩組樣品中揮發(fā)性物質(zhì)種數(shù)差異不大,但其組成成分存在明顯不同,僅接入魯氏酵母的苦蕎豆醬中獨有的2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、十五碳酸乙酯等風味成分賦予了豆醬獨特的風味;接入魯氏酵母和米曲霉組中,酯類物質(zhì)種數(shù)相對較少,但其含氮、含硫化合物種數(shù)明顯增多。