李卓虹+祝朝富+安佰平

摘要：目的 探討靛玉紅（Indirubin）對腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管形成影響。方法 采用肝癌HepG2細胞上清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）成為腫瘤血管內(nèi)皮細胞（tumor-derived endothelial cells，Td-EC），通過MTT法、細胞遷徙試驗、血管形成實驗檢測靛玉紅對HUVEC與Td-EC增殖、遷移、血管形成的影響。結(jié)果 靛玉紅在體外對Td-EC有顯著的生長抑制作用，并具有時間和濃度依賴性；一定濃度的靛玉紅能顯著降低Td-EC細胞遷徙活性和抑制血管的形成，而同樣條件下，靛玉紅對HUVEC的抑制作用弱于Td-EC。結(jié)論 靛玉紅在體外可特異地抑制Td-EC增殖、遷移、血管形成。

關(guān)鍵詞：靛玉紅；腫瘤血管內(nèi)皮細胞；增殖；遷移；血管形成

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）02-0072-04

【Abstract】Objective： To investigate the effect of indirubin on the proliferation， migration and angiogenesis of vascular endothelial cells. Methods： Human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） were induced to differentiate into tumor-derived endothelial cells （Td-EC） by HepG2 cell supernatant. MTT assay， cell migration assay and angiogenesis test were used to detect the effect of indirubin on the proliferation， migration and angiogenesis of HUVEC and Td-EC. Results： Indirubin had significant growth inhibitory effect on Td-EC in vitro and time and concentration dependence. Indirubin with certain concentration could significantly reduce the migration of Td-EC cells and inhibit the formation of blood vessels. In the similarity condition， the inhibitory effect of indirubin on HUVEC was weaker than that of Td-EC. Conclusion： Indirubin can specifically inhibit the proliferation， migration and angiogenesis of Td-EC in vitro.

【Key words】indirubin， tumor vascular endothelial cell， proliferation， migration， angiogenesis

腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，血管生成可為腫瘤組織提供充足的營養(yǎng)和氧氣，并帶走其代謝產(chǎn)物，因而抗腫瘤血管生成成為目前理想的抗癌治療策略[1]。靛玉紅是從我國傳統(tǒng)中藥青黛、板藍根、大青葉中提煉而成，已經(jīng)有大量研究表明靛玉紅具有抑制細胞周期[2]、殺傷腫瘤細胞以及抗炎[3]等多種功效。但對靛玉紅抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞生成的機制尚不清楚，本研究中，我們將探討靛玉紅對腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管形成影響，以期揭示其對腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長及相關(guān)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Trizol（Ambion公司），抗體（Santa公司），胰蛋白酶（HyClone公司），胎牛血清（Invitrogen公司），Matrix基質(zhì)膠（BD公司），人肝癌HepG2細胞（四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究室）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取健康、足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶20-30 cm，以胰酶灌注法分離臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用含20%胎牛血清、10 ng/L VEGF的PRMI1640 培養(yǎng)傳代，流式細胞術(shù)檢測Ⅷ因子相關(guān)抗原以鑒定HUVEC，人肝癌HepG2細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 液培養(yǎng)至70% 匯合時，換成無血清的RPMI1640 液再培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，于-80℃保存?zhèn)溆?。取?代HUVEC，用含體積分?jǐn)?shù)50% HepG2細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)，匯合至80%時收集細胞，即為腫瘤血管血管內(nèi)皮細胞（Td-EC），并可培養(yǎng)傳代。

1.2.2 RT-PCR 檢測 以正常HUVEC 為對照組，提取Td-EC細胞總RNA。根據(jù)TEM1及TEM8 的cDNA 設(shè)計引物，并由成都寶信生物工程技術(shù)有限公司合成。用RT-PCR來檢測TEM1及TEM8 mRNA的表達，總RNA用RevertAid First Strand cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。TEM1、TEM8和β-actin引物為：TEM1：5-cattatcccaactgcccagc-3（R）和5-ctgatgggtgaggtctggtt5-（F）；TEM8：5-gctgcaccactggaatgaaa-3（R）和5-gtctcctcctggcagaactt5-（F）β-actin：5-cctgcttgctgatccacatc-3（R）和5-cctctatgccaacacagtgc-3（F）用Deam Taq PCR Master Mix（2X）進行PCR。反應(yīng)條件為：95℃，3 min的預(yù)變性；95℃，30 s；68℃，30 s；72℃，1 min；30個循環(huán)；延伸72℃，10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠電泳成像系統(tǒng)進行觀察并采集圖片。

1.2.3 細胞增殖能力測定 采用MTT 法檢測細胞增殖能力，取對數(shù)生長期HUVEC、Td-EC細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104 cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔。以0、5、10 μmol/L濃度靛玉紅處理細胞。置37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24、48、72 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 μl/孔繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄原培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，室溫輕度振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm的OD值，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移能力測定 采用劃痕法測定腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移能力。將HUVEC及Td-EC細胞接種于6孔板，以0、5、10 μmol/L濃度靛玉紅處理細胞。待細胞融合后劃痕，48 h后，用導(dǎo)倒置顯微鏡觀察、拍照，測量劃痕距離。

1.2.5 血管形成實驗 在24孔板中加入matrigel膠（按1：2比例與無血清培養(yǎng)基混合），置37℃凝固后，將HUVEC、Td-EC細胞以1.5×105 cells/mL接種于24孔板中，每4 h觀察1次管腔形成情況，12 h終止培養(yǎng)。繼續(xù)加入5 μmol/L靛玉紅的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后觀察、計數(shù)。

1.2.6 體外侵襲能力實驗 細胞侵襲實驗采用Transwell 小室法。Transwell小室的上室膜鋪ECM 凝膠。下室加10% FBS 的培養(yǎng)液500 μl/室，上室接種無血清培養(yǎng)基過夜的HUVEC、Td-EC細胞，1×105cells/孔（200 μl），每組設(shè)3個平行孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出小室固定細胞，用上述方法染色計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均在SPSS21.0中進行，計量資料用（x±s）表示；各組組間比較采用t檢驗，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC的鑒定 HUVEC具有純度高、活性好，可在體外培養(yǎng)并可傳代七代以上的特性。培養(yǎng)細胞經(jīng)流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記（CD31、CD45、CD62、vWF）和對低密度脂蛋白（LDL）的吞噬功能檢測細胞純度[4-5]，用碘化丙錠（PI）檢測細胞活性，細胞純度和活性分別達到95%以上。結(jié)果見下表1、圖1。

2.2 腫瘤血管內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)生成及鑒定 RT-PCR 擴增產(chǎn)物的電泳顯示：從Td-EC 中能擴增出約290 bp 及460 bp 的條帶（圖2），說明HUVEC 經(jīng)HepG2細胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)后，細胞表達TEM1 和TEM8，這是腫瘤血管內(nèi)皮細胞特有的表達抗原，故誘導(dǎo)細胞具備了腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特性（見圖2）。

2.3 靛玉紅對Td-EC細胞增殖的影響 靛玉紅處理24 h 后，HUVEC、Td-EC細胞增殖能力均明顯受到抑制，并與時間及劑量成正相關(guān)，與對照組正常HUVEC、Td-EC 細胞相比，差異有顯著性，并具有時間和濃度依賴性（P<0.05）；而靛玉紅對HUVEC 細胞增殖能力抑制作用弱于Td-EC，對照組正常Td-EC細胞增殖能力強于HUVEC細胞（見圖3）。

2.4 靛玉紅對Td-EC細胞遷移能力的影響 靛玉紅處理48 h 后，HUVEC、Td-EC細胞遷移能力均明顯受到抑制，并與劑量成正相關(guān)，與對照組正常HUVEC、Td-EC 細胞相比，差異有顯著性，并具有濃度依賴性；靛玉紅對Td-EC細胞遷移能力抑制作用明顯強于HUVEC細胞（見圖4）。

2.5 靛玉紅對Td-EC細胞血管形成的影響 HUVEC是國內(nèi)外建立體外血管生成模型的常用細胞，利用其在膠原組織上的爬行、融合形成小管樣結(jié)構(gòu)來觀察研究藥物對小管形成的影響是經(jīng)典研究方法[6]。靛玉紅處理前，Td-EC細胞管腔形成能力明顯強于HUVEC（P<0.05），表明Td-EC細胞較正常HUVEC具有更強的血管形成能力。靛玉紅處理后，Td-EC細胞管腔形成能力明顯受到抑制（P<0.05），與HUVEC細胞相比，靛玉紅對Td-EC細胞血管形成能力抑制效果更明顯（P<0.05）（見圖5、表2）。

2.6 靛玉紅對Td-EC細胞體外侵襲能力的影響 HUVEC在靛玉紅處理前后細胞遷徙數(shù)無顯著性差異（P>0.05）；而Td-EC細胞經(jīng)靛玉紅處理后其遷徙數(shù)明顯減少（P<0.05）；未經(jīng)靛玉紅處理Td-EC細胞遷徙數(shù)明顯多于HUVEC細胞（P<0.05）。表明Td-EC 細胞較正常內(nèi)皮細胞具有更強的遷徙能力，利于腫瘤的生長，而對正常內(nèi)皮細胞的影響較小。（見圖6）

3 結(jié)論

靛玉紅為吲哚類化合物，存在于靛藍、多種腹足綱軟體動物、健康和患病人群的尿液，及各種野生型或重組細菌中[7]，靛玉紅最早被我國用于臨床治療慢性粒細胞白血病。近些年隨著研究的深入，靛玉紅及其衍生物不斷地被發(fā)掘，在抗炎、抗腫瘤、增強免疫[3，8，9]等方面均有顯著的療效。血管內(nèi)皮細胞是指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，它形成血管的內(nèi)壁。血管內(nèi)皮細胞具有吞噬異物、細菌、壞死和衰老組織的作用，還參與集體免疫活動。感染、炎癥情況下，內(nèi)皮細胞通過活化、釋放細胞因子、促血小板凝集等參與病理變化，其自身還可以發(fā)生凋亡或通過增殖而自我修復(fù)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，需伴隨血管內(nèi)皮細胞的異常增殖和血管新生[10]。

本研究證明靛玉紅在體外對Td-EC在增殖、遷移、血管形成以及侵襲能力均具有顯著的生長抑制作用，并具有時間和濃度依賴性；一定濃度的靛玉紅能顯著降低Td-EC細胞遷徙活性和抑制血管的形成，而同樣條件下，靛玉紅對HUVEC的抑制作用弱于Td-EC，說明相對正常內(nèi)皮細胞靛玉紅影響更加明顯。由于體外腫瘤血管內(nèi)皮細胞模型仍存在一定局限性，靛玉紅對腫瘤內(nèi)皮細胞生長抑制作用有待于動物體內(nèi)實驗的進一步證實，從而有利于新型抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長藥物的開發(fā)。

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（收稿日期：2016-10-26）